Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-27179
Titel: The Role of Synaptobrevin2 in Exo-Endocytosis in Primary Mouse Cytotoxic T Lymphocytes
Verfasser: Bzeih, Hawraa
Sprache: Englisch
Erscheinungsjahr: 2016
Erscheinungsort: Homburg/Saar
SWD-Schlagwörter: Lymphozyten
Synaptobrevine
Freie Schlagwörter: Zytotoxische T Lymphozyten
Synaptobrevin2
DDC-Sachgruppe: 610 Medizin, Gesundheit
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: Zytotoxische T Lymphozyten (CTLs) töten Zielzellen durch die Freisetzung von Substanzen aus sogenannten zytotoxischen Granulen (CGs). Da CTLs in der Lage sind, mehrere Zielzellen sequentiell zu töten, werden sie auch als „Serial Killers“ bezeichnet. Voraussetzung für diesen Prozess ist ein schnelles Erneuern von CGs. Diese Erneuerung könnte durch komplette de novo Synthese erfolgen oder aber durch Recycling noch verwendbarer Komponenten mit partieller Neusynthese. Um das Recycling besser zu verstehen, haben wir den endocytotischen Weg von Synaptobrevin2 (Syb2), dem v-SNARE von CGs von Maus-CTLs untersucht. Diese Untersuchungen wurden an CTLs von Syb2-mRFP Knockin (Sybki) Mäusen durchgeführt. Durch Exozytose an die Oberfläche gelangtes Syb2-mRFP (weiterhin abgekürzt als Syb2) wurde mit anti-mRFP Antikörpern markiert und so die folgende Endozytose und Prozessierung in den CTLs untersucht. Wir begannen unsere Studie am Zeitpunkt der Fusion CGs mit der Plasmamembran. Durch Co-Immunopräzipitationsexperimente konnten wir zeigen das Syb2 mit dem synaptosomal-assoziierten Protzein-23 (SNAP-23) während der SNARE-Komplexbildung assoziiert. Diese Interaktion dürfte der Fusion von CGs mit der Plasmamembran dienen. SNAP-23 ist als wahrscheinlich ein t-SNARE der CG Fusion. Nach der Fusion von CGs mit der Plasmamembran erscheint das an Syb2 fusionierte mRFP auf der Zelloberfläche. Die Benutzung Fluoreszenz-markierter anti-RFP Antikörper erlaubt dann das Verfolgen von Syb2 während des endozytotischen Prozesses. Wir konnten verschiedene Proteine identifizieren, die, zumindest bis zur Fusion mit Early Endosomes (frühen Endososmes), zusammen mit Synaptobrevin2 im selben Vesikel auftraten und somit gleichzeitig endozytiert wurden. Proteine, die mit Synaptobrevin2 endozytiert wurden sind das t-SNARE SNAP23, das zeta-Kette- assozierte-70 kDA-Tyrosin-Phoshoprotein (ZAP70) und das CG-Membranprotein H+ V-ATPase. Diese Ergebnisse wurden mit hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie erhoben, wobei Proben vor der Untersuchung zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Stimulation fixiert wurden. Die Endozytose der V-ATPase zusammen mit Syb2 wurde außerdem durch live cell Experimente verifiziert, bei denen das Ansäuern endozytierter und Syb2-enthaltender Vesikel innerhalb von nur 1-2 Minuten nach Stimulation der Zellen gezeigt werden konnte. Endozytiertes Syb2 erreichte 15 min nach dem initialen Stimulus Early Endosomes (frühe Endosomen), wie durch Kolokalisation mit eGFP-RAB5 (einem Early Endosome Marker) gezeigt wurde. Nach 60 min schließlich erreichte endozytiertes Syb2 die Late Endosomes (späte Endosomen, Marker eGFP-RAB7). Hingegen konnten wir kein endozytiertes Syb2 in Recycling Endosoms (Marker eGFP-Rab11) finden. Um herauszufinden, ob Vesikel, die endozytiertes Syb2 enthalten, zu neuen zytotoxischen Granulen heranreifen, haben wir untersucht, ob diese Vesikel das als Marker für reife zytotoxische Granulen geltende apoptotische Protein GranzymB aufnehmen. Wir fanden, dass GranzymB mit Syb2 nach 60 min kolokalisiert, also nach derselben Zeit der maximalen Kolokalisation mit Late Endosomes. Unsere Studie identifiziert SNAP-23 als t-SNARE, das mit dem V-SNARE Syb2 interagiert um die Fusion von CGs zu initiieren. Außerdem wird gezeigt, das exozytiertes Syb2 zusammen mit anderen Komponenten von CGs endozytiert wird und während der Reifung lediglich fehlende Proteine wie Granzym B neu eingebaut werden. Dieser Prozess könnte für das „Serial Killing“ von CTLs wichtig sein.
Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) kill target cells by releasing the content of their cytotoxic granules (CGs). CTLs are known as serial killers due to their ability to kill multiple target cells. Serial killing requires that CTLs replenish their CGs to be available for a new round of killing. Newly produced CGs could be formed by de novo synthesis or by recycling of their components to ensure fast replenishment of mature CGs. To better understand the mechanism of recycling of CG components, we studied the endocytosis pathway of synaptobrevin2 (Syb2), the v-SNARE present on CGs of murine CTLs. In order to specifically follow up Syb2 we used CTLs from Syb2-mRFP knock-in (sybki) mice and utilized anti-RFP antibody to track Syb2-mRFP (Shortly, Syb2) after CG fusion and Syb2 exposure at the plasma membrane. We started our study from the point of CG fusion with the plasma membrane. Using co-immunoprecipitation, we found that Syb2 interacts with synaptosomal-associated protein-23 (SNAP-23) during SNARE complex formation to initiate fusion of CGs with the plasma membrane, indicating that SNAP-23 is a t-SNARE required for CG fusion. After exposure of Syb2 at the plasma membrane upon CG fusion, the mRFP fused to Syb2 faces to the extracellular medium. Utilizing fluorescently-labeled anti-RFP antibody allows for tracking the endocytic pathway followed by Syb2. We identified some proteins that were endocytosed with Syb2 in the same vesicle, at least until it fuses with early endosomes. Proteins endocytosed with Syb2 include the t-SNARE SNAP-23, zeta-chain associated 70 kDa tyrosine phosphoprotein (ZAP70) and a CG membrane protein the H+ V-ATPase. These results were shown using high resolution imaging of fixed cells at different time points. Endocytosis of the V-ATPase with Syb2 in the same vesicle was further verified using live cell imaging, where the acidification of endocytosed Syb2-containing (endo-Syb2) vesicles occurred within one to two minutes (min) of Syb2 exposure at the plasma membrane. Endo-Syb2 arrives at the early endosomes within 15 min of target cell addition; shown by its colocalization with eGFP-Rab5, the early endosomal marker. From the early endosomes, endo-Syb2 further traffics to late endosomes within 60 min of target cell addition but not through recycling endosomes, also shown by its colocalization with eGFP-Rab7 but not with eGFP-Rab11, the markers for late and recycling endosomes, respectively. In order to investigate whether endo-Syb2 vesicles would undergo maturation to become fully mature CGs, we tested whether they would regain granzyme B, the marker of mature CGs, when and where. We found that endo-Syb2 vesicles colocalized with granzyme B at the late endosomes within 60 min of target cell addition, at the time where endo-Syb2 shows maximum colocalization with late endosomes. Our study identifies SNAP-23 as a t-SNARE interacting with the v-SNARE Syb2 to initiate CG fusion. It further shows that Syb2 is endocytosed along with other components of CGs where this might be important for the replenishment of fully mature CGs containing granzyme B and ready for another round of target cell killing, a critical aspect of CTL function.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-ds-271796
hdl:20.500.11880/27034
http://dx.doi.org/10.22028/D291-27179
Erstgutachter: Rettig, Jens
Tag der mündlichen Prüfung: 20-Mär-2017
SciDok-Publikation: 14-Mai-2018
Fakultät: M - Medizinische Fakultät
Fachrichtung: M - Physiologie
Fakultät / Institution:M - Medizinische Fakultät

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