Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-27063
Titel: Charakterisierung humaner CD4+ T-Zell Subtypen : Characterization of human CD4+ T cell subtypes
Verfasser: Kircher, Sarah
Sprache: Deutsch
Erscheinungsjahr: 2017
Erscheinungsort: Homburg/Saar
SWD-Schlagwörter: Antigen CD4
Freie Schlagwörter: T-Zell Subtypen
DDC-Sachgruppe: 610 Medizin, Gesundheit
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: Durch Antigenkontakt über antigenpräsentierende Zellen differenzieren naive CD4+ Zellen zu unterschiedlichen Effektor Subtypen, T-Helfer-Zellen und regulatorische T-Zellen. Dabei ist die Balance der Subtypen kritisch für eine adäquate Immunantwort. Ist das Verhältnis zwischen den Subtypen nicht ausgeglichen, können Autoimmunerkrankungen oder ungenügende Immunantworten die Folge sein. Die kritische Rolle von Kalzium bei der T-Zell Aktivierung und Zytokinsekretion ist bekannt, während der Einfluss auf Entwicklung und Aktivierung der einzelnen CD4+T-Zell Subtypen weniger gut verstanden ist. In dieser Arbeit wurde die in-vitro Differenzierung humaner peripherer CD4+ T-Zellen in die Subtypen Th1, Th2, Th17 und regulatorische T-Zellen über Zytokinkonzentration und Stimulationsdauer etabliert und optimiert. Die Effizienz der Polarisierung wurde mittels durchflusszytometrischer Messung der Zytokinprofile überwacht. Parallel dazu wurde der speichergesteuerte Kalziumeinstrom (SOCE, store operated calcium entry) der CD4+ T-Zell Subtypen mittels Fura-2 AM basiertem Ca2+-Imaging charakterisiert. Der speichergesteuerte Kalziumeinstrom wurden sowohl über Speicherentleerung mittels Thapsigargin als auch über die Nachahmung eines physiologischen Stimulus mittels αCD3/αCD28 Aktivator Beads induziert. Dabei wiesen Treg verglichen mit den Subtypen Th0, Th1 und Th2 und Th17 sowohl nach Thapsigargin Stimulation als auch nach αCD3/αCD28 Aktivator Bead Stimulation höhere und anhaltendere Kalziumsignale auf. Die T-Helfer-Subtypen Th1, Th2 und Th17 zeigten dagegen niedrigeren Einstrom von Kalzium. Interessanterweise unterschieden sich die Kalziumphänotypen von Th1, Th2 und Th17 je nach Stimulus. Allerdings wiesen alle in-vitro polarisierten CD4+ T-Zell Subtypen deutliche und signifikante Unterschiede in ihren Kalziumprofilen auf. Um die Unterschiede der Kalziumphänotypen mit der Expression der CRAC Komponenten vergleichen zu können, wurde mittels qRT-PCR Messungen und Western Blot Analysen die Expression der CRAC Komponenten auf RNA und Proteinebene untersucht. Für Th0, Th1 und Treg konnten jedoch keine signifikanten Unterscheide in den Proteinlevel von Orai1, STIM1 und STIM2 gefunden werden. Auch die Expressionslevel der CRAC Komponenten auf mRNA Ebende ließen sich nicht mit den Kalziumphänotypen korrelieren. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass bereits IL-12 Behandlung alleine in untouched CD4+ T-Zellen eine Reduktion von SOCE bewirkt, sowie einen Anstieg des Th1 spezifischen Transkriptionfaktors T-bet induziert. Dies deutet auf eine wichtige Rolle von IL-12 in der Regulation Kalzium-abhängiger Prozesse in Th1 hin. Zusammengenommen weisen die Daten auf differentielle Kalziumprofile von Effektor T-Zellen hin. Ob und wie die spezifischen Kalziumphänotypen die Immunantwort verändern, muss noch weiter untersucht werden. Da die Kalziumphänotypen der in-vitro polarisierten CD4+ T-Zell Subtypen nicht alleine durch die absoluten Mengen der CRAC Komponenten Orai1, STIM1 und STIM2 erklärt werden können, wurde die Rolle anderen Kanäle und Spleißvarianten untersucht, die die Kalziumprofile der CD4+ T-Zell Subtypen beeinflussten könnten. Hierfür wurde die Rolle der neuen inhibitorischen Spleißvariante STIM2.1 mittels Herunterregulation durch siRNA untersucht. Interessanterweise waren die Kalziumsignale von Treg und Th1 nicht durch die verminderte Expression der Spleißvariante betroffen, während die Subtypen Th2, Th17 und die Kontrolle Th0 den bereits publizierten Anstieg von [Ca2+]i nach der Herrunterregulation des Inhibitors zeigten. Weiterhin konnte durch eine siRNA vermittelte Herunterregulation des CRAC (calcium release activated calcium) Kanals Orai auch überraschende Unterschiede in Treg beobachtet werden. Th0 und Th1 zeigten die erwartete Verringerung des Kalziumsignals, während der [Ca2+]i in Treg durch die siRNA Transfektion nicht negativ beeinflusst wurde. Der Einfluss von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen (CaV)auf den speichergesteuerten Kalziumeinstrom in Lymphozyten wird kontrovers diskutiert. Aus diesem Grund wurden die L-Typ CaV mittels pharmakologischer Substanzen blockiert und der Einfluss der Inhibition auf SOCE gemessen. Dabei konnten nur sehr moderate Effekte auf SOCE festgestellt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich die signifikanten Kalziumphänotypen der in vitro polarisierten CD4+ T-Zell Subtypen nicht durch eine differentielle Regulation über L-Typ CaV erklären lassen. Um die Kalziumprofile der in vitro polarisierten CD4+ T-Zell Subtypen genauer zu charakterisieren, wurde außerdem die Sensitivität von SOCE gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxygen species) untersucht. Anhand der gemessenen Daten konnte jedoch keine differentielle Sensitivität der CD4+ Subtypen gegenüber ROS festgestellt werden. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit die in vitro Polarisierung humaner CD4+ T-Zell Subtypen etabliert werden, welche signifikante Kalziumphänotypen aufweisen. Möglicherweise beeinflussen die neue inhibitorische Spleißvariante STIM2.1 und der CRAC Kanal Orai1 die Kalziumprofile der Subtypen zu einem unterschiedlichen Grad. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass der Effekt von Orai1 und STIM2.1 kein ubiquitärer Effekt, sondern möglicherweise zellspezifisch sein könnte und sich in den Subtypen grundlegend unterscheidet. Dieser differentielle Einfluss der verschiedenen CRAC Komponenten könnte die Kalziumphänotypen teilweise erklären. Welche weiteren Faktoren für das Zustandekommen der unterschiedlichen Kalziumprofile innerhalb der CD4+ Subpopulationen verantwortlich sind, kann auf Basis dieser Arbeit in Zukunft noch weiter untersucht werden.
Antigen mediated stimulation of naïve CD4+ T cells triggers differentiation into effector regulatory or helper subtypes in a cytokine and antigen dependent manner. Imbalances between resulting subtypes can lead to an inadequate immune response or can contribute to autoimmune disease. The crucial role of Calcium in the activation and cytokine secretion of T cells is well characterized, however how the individual subtype response is shaped by differential calcium signatures or how or if alterations in the signature influence the fate of a given subtype is less clear In this thesis, the in-vitro differentiation of human peripheral CD4+ T cells into Th1, Th2, Th17 or regulatory (Treg) T cells was optimized by alteration of the supplied cytokines and duration or intensity of the applied stimulation. Efficiency of polarization was monitored by flow cytometry and parallel to cytokine secretion or polarization, the corresponding store-operated Ca2+ entry (SOCE) phenotype of these cells were determined by single cell Fura-2 measurements. Calcium signals were measured after store depletion with Thapsigargin and after mimicking a more physiological stimulus using αCD3/αCD28 activator beads. Treg cells showed a higher and more sustained [Ca2+]i in response to both Thapsigargin mediated store depletion and bead stimulation when compared to non-polarized cells, effector Th1, Th2 and Th17 showed a lower [Ca2+]i . Notably the calcium phenotypes of Th0, Th1, Th2 and Th17 differ dependent from the applied stimulus. Nevertheless all subtypes showed substantial and significant calcium phenotypes. To investigate whether these differences are due to differential expression of the major components of SOCE we measured by qRT-PCR and Western blot the mRNA and protein expression of STIM and Orai genes and proteins. But for Treg, Th1 and control Th0 we did not find significant differences in the protein levels of Orai1, STIM1 and STIM2. In addition IL-12 treatment alone of untouched CD4+ cells led to a significantly reduced SOCE and an increase in the Th1 signature transcription factor T-bet, indicating an important role of IL-12 in regulating Ca2+-dependent processes or components in Th1 cells. Altogether, our results point to a differential Ca2+ profile of effector T cells. If these profiles influence the outcome of the downstream immune response needs to be further elucidated. Since the absolute levels of CRAC proteins Orai1, STIM1 and STIM2 do not seem to be the sole source of the differential calcium phenotypes of the in-vitro polarized CD4+ T-cell subtypes, splice variants or other channels conducting calcium may influence the observed differences. Therefore we investigated the role of the new inhibitory splice variant STIM2.1 by siRNA approach. Interestingly, SOCE profiles of Th1 and Treg are not affected by the STIM2.1 downregulation, whereas Th2, Th17 and Th0 exhibit the already described increase of [Ca2+]i after knocking down the inhibitor. By knocking-down the CRAC Channel Orai1 we found surprising differences for regulatory T-cells, too. The down regulation of Orai1 in Th0 and Th1 leads to decreased [Ca2+]i, whereas in Treg the calcium signals are not negatively affected but rather increased by the siRNA based downregulation of Orai1. Because the role of voltage gated L-type CaV channel on SOCE is controversly discussed, we pharmacologically influenced the L-type CaV channels by different blockers and measured the effect on SOCE profiles in in-vitro CD4+ T-cell subtypes after calcium-readdition protocol and TCR engagement. We found only very slight effects of L-Type CaV blockers on SOCE in T-cell subtypes. In our hands these effects cannot explain the observed substantial differences in SOCE profiles of in-vitro polarized CD4+ T-cell subtypes. Moreover we cannot rule out, that the differences are caused by an unspecific effect of CaV channel blockers on K+ channels. It is possible that other regulators that affect SOCE play a role in the differential calcium signals of in-vitro polarized CD4+ T-cell subtypes in particular in Treg, since our data point to an alternative regulation of calcium signals in Treg . For further characterization of SOCE in T helper subtypes, we investigated the sensitivity of SOCE against reactive oxygen species (ROS), but found that CD4+ subtypes do not seem to be differentially sensitive against ROS. In summary, we successfully established in-vitro polarization of human CD4+ subtypes and found significant and substantial calcium phenotypic differences within the in-vitro polarized CD4+ T-cell subtypes. The new splice variant STIM2.1 and also Orai1 might influences the calcium signals in the subtypes to a different extent, although the absolute levels of both do not seem to be different. These differences may partly but not solely explain the observed differences in calcium signals. The major factors influencing the observed phenotypes, as well as the differences in calcium signals after passive store depletions and TCR engagement need to be further elucidated.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-ds-270636
hdl:20.500.11880/26955
http://dx.doi.org/10.22028/D291-27063
Erstgutachter: Niemeyer-Hoth, Barbara
Tag der mündlichen Prüfung: 23-Okt-2017
SciDok-Publikation: 26-Feb-2018
Fakultät: M - Medizinische Fakultät
Fachrichtung: M - Biophysik
Fakultät / Institution:M - Medizinische Fakultät

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