Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-26889
Titel: Nachweis von Genamplifikationen und „unter-replikation“ mittels FISH und qPCR während der Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen
Verfasser: Altmayer, Nora Corinna
Sprache: Deutsch
Erscheinungsjahr: 2017
Erscheinungsort: Homburg/Saar
SWD-Schlagwörter: Mesenchymzelle
Genamplifikation
DDC-Sachgruppe: 610 Medizin, Gesundheit
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: Genamplifikationen kommen während der Entwicklung in bestimmten Zellen in Amphibien und Fliegen vor. Beim Menschen stellen Genamplifikationen ein charakteristisches Merkmal in Tumorzellen dar, wohingegen Genamplifikationen in normalen menschlichen Zellen lange unentdeckt blieben. Seit kurzem ist bekannt, dass Genamplifikationen auch in neuralen Progenitorzellen der Maus und des Menschen, sowie in Myoblasten der Maus und des Menschen vorkommen. Dies wirft die Frage auf, ob in Vorläuferzellen von Adipozyten und Osteozyten ebenfalls Genamplifikationen zu finden sind. In dieser Arbeit wurden humane mesenchymale Stammzellen entweder in Richtung Adipozyten oder in Richtung Osteozyten differenziert. Zellen beider Versuchsreihen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten auf Amplifikationen hin untersucht. Dies erfolgte zunächst mittels Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung auf Einzelzellniveau und anschließend mittels qPCR. Aufbauend auf vorhergehenden Array-CGHs (array comparative genomic hybridisation) von Stammzellen, die sowohl in Richtung Adipozyten als auch in Richtung Osteozyten differenziert wurden, konnten verschiedene amplifizierte und/oder unter-replizierte DNARegionen nachgewiesen werden, die in dieser Arbeit mittels fluoreszenzmarkierter Bacterial Artificial Chromosoms (BACs) bestätigt wurden. Um Amplifikationen und „unter-replizierte“ Regionen detektieren zu können, wurden diese BAC-Sonden mit Hilfe der Nicktranslation fluoreszenzmarkiert. Mesenchymale Stammzellen wurden unterschiedlich lang differenziert und mittels Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung untersucht. Für einzelne ausgewählte amplifizierte Chromosomenregionen wurden Gene ausgesucht und eine Verifikation der Amplifikationen und/oder „unter-replikation“ mittels qPCR durchgeführt. Diese Gene liegen zum Teil in den DNA-Regionen, die mit den entsprechenden BAC-Sonden hybridisieren oder sie befinden sich in chromosomaler Nähe zu diesen DNA-Regionen, die mit den entsprechenden BAC-Sonden hybridisieren. Es konnten erstmals Amplifikationen und „unter-replizierte“ Regionen in humanen mesenchymalen Stammzellen detektiert werden, die nicht differenziert wurden, in humanen mesenchymalen Stammzellen, die unterschiedlich lange in Richtung Adipozyten differenziert wurden und in humanen mesenchymalen Stammzellen, die unterschiedlich lange in Richtung Osteozyten differenziert wurden. Damit wurde ein weiterer Beleg dafür geliefert, dass Genamplifikationen in unterschiedlichen Stammzellen des Menschen während ihrer Differenzierung vorkommen. Innerhalb der amplifizierten chromosomalen Regionen befinden sich auch DNA-Regionen, die für bestimmte Proteine kodieren wie z.B. CDK4 oder MDM2. Diese Gene liegen in einer Reihe von Tumoren amplifiziert vor.
Gene amplifications occur in certain cells of amphibians and flies during development. In humans gene amplifications are an attribute of tumor cells whereas gene amplifications in normal human cells remained undetected for a long time. As of late there is evidence that gene amplifications appear in human and mouse neural progenitor cells as well as in human myoblasts and in mouse myoblasts. This raises the question if one can find gene amplifications in progenitor cells of adipocytes and of osteocytes. This study describes the amplification analysis of human mesenchymal stem cells and mesenchymal stem cells differentiated towards adipocytes and osteocytes at different time points. Amplification analysis was performed using two techniques, first fluorescence in situ hybridization and second qPCR. Starting point were results from a previous array CGH that analyzed human mesenchymal stem cells and differentiation of human mesenchymal stem cells towards adipocytes and osteocytes. Several DNA regions were detected amplified and/or under-replicated in array- CGH analysis. Bacterial artificial Chromosomes (BAC) for selected amplified and underreplicated chromosome regions were fluorescence labeled using nick translation and used in FISH experiments against mesenchymal stem cells and mesenchymal stem cells differentiated towards adipocytes and osteocytes. In a second approach several genes were analyzed for amplification using qPCR. Genes were selected according to their location within chromosome regions that correspond to BAC probes used in FISH experiments or their location next to the BAC specific chromosome region. Gene amplifications were detected in undifferentiated human mesenchymal stem cells and in mesenchymal stem cells differentiated towards adipocytes and osteocytes at several selected time points. In conclusion this study has shown for the first time that gene amplification occur in human mesenchymal stem cells and in human mesenchymal stem cells differentiated towards adipocytes and osteocytes. This study has provided further evidence that gene amplification can be found in various human stem cells during differentiation. Amplified chromosomal regions included several genes for example CDK4 or MDM2 that are also amplified in multiple different tumors.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-ds-268891
hdl:20.500.11880/26878
http://dx.doi.org/10.22028/D291-26889
Erstgutachter: Fischer, Ulrike
Tag der mündlichen Prüfung: 18-Sep-2017
SciDok-Publikation: 16-Nov-2017
Fakultät: M - Medizinische Fakultät
Fachrichtung: M - Humangenetik
Fakultät / Institution:M - Medizinische Fakultät

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