Microfluidic schemes to study free standing lipid bilayer interactions and protein bilayers

Abstract

In the present thesis, a microfluidic scheme with simultaneous optical and patch clamping access is developed to study membrane fusion, its intermediated states and hydrophobin protein bilayers. As a first application, the formation of a free standing hemifused state due to the interaction of free standing lipid bilayers is studied. The hemifusion state is shown to be the result of a dewetting process under no-slip boundary conditions. Furthermore, the microfluidic scheme is extended to study membrane fusion by means of SNARE proteins; small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins are allow to contact a free standing lipid bilayer containing t-SNARE proteins, bilayer-vesicle fusion occurs via t-SNARE/v-SNARE complex formation. Single fusion events were characterized using fluorescence and capacitance measurements. As a third application, the microfluidic scheme is used for the production of free standing hydrophobin protein bilayers. Adhesion properties of the protein bilayers were characterized as a function of both the protein orientation and its charged amino acids distribution. For that, three mutation variants and the wild type protein were used. The obtained results revealed that a reduction of the absolute number of charges on the protein surface leads to an increase of the adhesion energy between protein leaflets.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein mikrofluidisches Verfahren zur gleichzeitig optisch und elektrophysiologisch Untersuchung der membranen Fusion und deren Wechselwirkungen entwickelt. Zuerst, wird die formation einer Hemifusion studiert, die sich bildet wenn zwei frei stehende Lipid Doppellagen kontaktiert werden; dies geschieht durch einen Entnetzungsprozess mit Haftrandbedingung. Zweitens, einfache SNARE vermittelnde Fusions Ereigniße werden erzeugt. Über Ca2+ vermittelte Fusion von t-SNARE dotierten Vesikeln mit einer Lipiddoppellage werden zuerst t-SNARE‗s in die Doppellage eingefügt. Danach werden v-SNARE dotierte Vesikel eingespült und in Kontakt mit der Doppellage gebracht. Die nachfolgende Fusion wird durch die Bildung von t-SNARE/v-SNARE–Komplexen vermittelt. Aufgrund der Fusion beider, der t-SNARE/v-SNARE Interaktion mit Calcium Ionen war diese charaktarisiert durch die Nutzung von Fluoreszenz- und Kapazitäts messungen. Es zeigt sich, dass die SNARE vermittelte Fusion schneller ist als die Ca2+. Drittens, wird das mikrofluidische Verfahren außerdem noch verwendet um freistehende Hydrophobinen-Doppellagen herzustellen. Die Ahesionseigenschaften der Protein Doppellagen wurden charakterisiert als eine Funktion beider, der protein orientierung und seiner Aminosäuren Wechselwirkungsenergie . Dafür wurden drei Mutations Varianten sowie der ursprüngliche Typ des proteins verwendet. Die erhaltenen Resultate lassen darauf schließen das eine reduktion der Anzahl der Wechselwirkungsenergien an der Protein Oberfläsche zu einer Erhöhung der Adhesionserergie zwischen den Protein Lagen führt.