Synthesis of UDP-glucose, UDP-glucuronic acid and NRP luminmide using permeabilized cells

Abstract

In the presented thesis permeabilized cells were used as whole cell biocatalyst. During permeabilization cells are treated with detergents causing the cell envelope to become permeable to small molecules. During this process, the macroscopic cell structure remains intact and macromolecules such as enzymes stay within the cell. After permeabilization and removal of metabolites the resulting “enzyme bags” are used as catalyst. Permeabilized E. coli cells were applied to synthesize UDP-glucose. The cells were treated with the detergent Triton X-100 for permeabilization. UDP-glucose was synthesized from uridine monophosphate with 60% yield. ATP was regenerated and glucose-1-phosphate was synthesized from sucrose after introduction of the sucrose phosphorylase gene. Furthermore, an S. pombe strain expressing the human UDP-glucose dehydrogenase gene was applied to synthesize UDP-glucuronic acid. This organism was permeabilized with Triton X-100 as well. Product yield was 100% when UDP-glucose and NAD+ were used as substrates. An E. coli strain harboring the plu3263 gene cluster from Photorhabdus luminescens was used for the synthesis of luminmide type cyclic pentapeptides, belonging to the class of nonribosomally biosynthesized peptides (NRP). Cells were fully permeabilized using toluene. Apparent kinetic parameters for the synthesis of the main product, luminmide A, were determined. Additionally, several natural and a non-natural luminmides were synthesized.

In der vorliegenden Arbeit wurden permeabilisierte Zellen als Ganzzellbiokatalysator verwendet. Bei der Permeabilisierung werden Zellen mit Detergenzien behandelt, wodurch die Zellhülle für kleine Moleküle durchlässig wird. Die Zellen bleiben dabei makroskopisch intakt, und Makromoleküle wie etwa Enzyme verbleiben in den Zellen. Die so erhaltenen „Enzymbeutel“ werden als Katalysator eingesetzt. Mittels permeabilisierter E. coli wurde UDP-Glukose mit einer Ausbeute von 60% aus Uridinmonophosphat synthetisiert. Die verwendeten Zellen wurden mit dem Detergenz Triton X-100 permeabilisiert. Das für die Synthese benötigte ATP wurde regeneriert und Glukose-1-Phosphat wurde mittels Sucrose Phosphorylase aus Saccharose gewonnen. Das Sucrose Phosphorylase Gen wurde heterolog eingebracht. Weiterhin wurde ein S. pombe Stamm, welcher das humane UDP-Glukose Dehydrogenase Gen exprimiert, zur Synthese von UDP-Glukuronsäure, verwendet. Auch dieser Organismus konnte mit Triton X-100 permeabilisiert werden. Es wurde eine Ausbeute von 100% erzielt. Ein E. coli Nissle Stamm, welcher den plu3263 Gencluster aus Photorhabdus luminescens beherbergt, wurde zur Synthese von Luminmiden, zyklischen, nicht ribosomal synthetisierten Pentapeptiden, verwendet. Hier war Toluol bei der Permeabilisierung der Zellen am effektivsten. Es wurden scheinbare kinetische Parameter für die Bildung des Hauptproduktes berechnet. Weiterhin wurden einige natürliche und ein nicht natürliches Luminmid Derivate synthetisiert.