Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-23100
Titel: Steroid conversions with the CYP106A subfamily from Bacillus megaterium
Sonstige Titel: Steroid-Umsätze mit dem CYP106A Familie aus Bacillus megaterium
Verfasser: Kiss, Flora Marta
Sprache: Englisch
Erscheinungsjahr: 2015
SWD-Schlagwörter: Enzym
Steroide
Biokonversion
Bacillus megaterium
Freie Schlagwörter: Cytochrom P450
CYP106A1
CYP106A2
Cytochrome P450
CYP106A1
CYP106A2
steroid
DDC-Sachgruppe: 570 Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: Regio- and stereoselective hydroxylation represents a major challenge for synthetic chemistry. The cytochrome P450 subfamily CYP106A efficiently catalyzes such reactions in steroids, di-, and triterpenes. The well-studied CYP106A2, from B. megaterium ATCC 13368, is a promising candidate for the pharmaceutical industry. It shares 63% amino acid sequence identity with CYP106A1 from B. megaterium DSM 319 which was recently identified. The global objective of the work was the in depth characterization of the CYP106A subfamily concerning the bioconversion of steroids, to explore their potential application as industrial biocatalysts. A focused steroid library was screened with the CYP106A subfamily. Binding studies, in vitro and in vivo reactions allowed the comparison of enzyme activity, product pattern and product structures. 13 new substrates were identified for CYP106A1 and 7 for CYP106A2. The hydroxylase activity was confirmed at positons 6β, 7β, 9α and 15β, in addition to an unprecedented 11-oxidase activity. The 11-oxidase activity of CYP106A1 was further studied, identifying 3 11β-hydroxysteroids as novel substrates for 11-oxidation. The reaction mechanism was also investigated, resulting in a large inverse kinetic isotope effect (~0.44) suggesting the ferric peroxoanion as the reactive intermediate. The CYP106A2 based B. megaterium whole-cell system has shown effective 15β-hydroxycyproterone acetate production. The conversion was scaled up from shake flask to bench-top bioreactor, the reaction-bottlenecks were identified and addressed, demonstrating a successful process development with a product formation of 0.43 g/L, approaching industrial process requirements and a future large-scale application.
Regio- und stereoselektive Hydroxylierung stellt für die synthetische Chemie eine ernste Herausforderung dar. Die CYP106A-Subfamilie der Cytochrome P450 katalysiert diesen Reaktionstyp auf effiziente Weise für Steroide, Di- und Triterpene. Das intensiv untersuchte CYP106A2 aus B. megaterium ATCC 13368 teilt 63% Sequenzidentität mit CYP106A1 aus B. megaterium DSM 319, das erst kürzlich identifiziert wurde. Das Ziel der Arbeit war, beide Enzyme in Bezug auf den Umsatz von Steroiden zu charakterisieren und ihre potenzielle Anwendung als industrielle Biokatalysatoren zu erkunden. Ein Steroidbibliothek-Screening wurde mit den CYP106A-Enzymen vorgenommen. Bindungsstudien, in vitro- und in vivo-Reaktionen ermöglichen den Vergleich der Enzymaktivität, der Produktmuster und der Produktstrukturen. 13 neue Substrate wurden für CYP106A1 und 7 für CYP106A2 identifiziert. Die Hydroxylaseaktivität wurde für die Positonen 6β, 7β, 9α und 15β, zusätzlich zu einer 11-Oxidaseaktivität bestätigt. Die 11-Oxidaseaktivität von CYP106A1 wurde untersucht und 3 11β-Hydroxysteroide als neue Substrate für die 11-Oxidation identifiziert. Der in mechanistischen Studien große inverse kinetische Isotopeneffekt (~ 0,44) deutet auf ein Eisen(III)-peroxoanion als reaktives Zwischenprodukt hin. Das CYP106A2-B. megaterium-Ganzzellsystem hat sich als effizienter Katalysator für die Herstellung von 15β-Hydroxycyproteronacetat erwiesen. Die Reaktion wurde von Schüttelkolben auf einen Tischbioreaktor hochskaliert, die Hauptengpässe der Reaktion beseitigt und somit ein Prozess erfolgreich etabliert. Die Produktausbeute von 0.43 g/L, bietet eine Basis für eine zukünftige Anwendung im industriellen Maßstab.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-62789
hdl:20.500.11880/23156
http://dx.doi.org/10.22028/D291-23100
Erstgutachter: Bernhardt, Rita
Tag der mündlichen Prüfung: 23-Okt-2015
SciDok-Publikation: 10-Nov-2015
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
Fachrichtung: NT - Biowissenschaften
Fakultät / Institution:NT - Naturwissenschaftlich- Technische Fakultät

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