In Vitro and In Vivo characterization of CYP11A1, CYP17A1 and cChloramphenicol acetyltransferase-dependent steroid conversion

Abstract

This Thesis provides an evidence for a direct stimulation of the CYP11A1-dependent side-chain cleavage activity by the sex hormones estrone and estradiol in a reconstituted in vitro system and demonstrates for the first time a novel activity for this enzyme to perform hydroxylation reactions on four steroid hormones 11-deoxycorticosterone (DOC), androstenedione, testosterone and dehydroepiandrosterone (DHEA). These new hydroxylated products might be useful to generate pharmaceutically interesting compounds. Furthermore, another important steroid modification was performed in this study by the establishment of a novel and efficient Escherichia coli based biocatalyst using chloramphenicol acetyltransferase I (CATI) as a steroid acetyltransferase. The results clearly revealed the important role of bacterial CATI in a new strategy for 21-hydroxysteroid acetylation. Moreover, it was investigated that pregnenolone sulfate (PregS) represents a starting material for a steroidogenic pathway of sulfonated steroids. The results in this work clearly proved the role of bovine CYP17 in the catalysis of PregS conversion to its corresponding hydroxylated product, 17-hydroxy-pregnenolone sulfate (17-hydroxy-PregS) and showed that cytochrome b5 has no influence on 17,20-lyase activity of CYP17 dependent PregS conversion. For this, the expression and purification processes of three necessary proteins, bovine cytochrome P450 reductase (CPR), cytochrome b5 and CYP17 were developed for the in vitro substrate characterizations.

Die vorliegende Arbeit liefert Aufschluss über die direkte Stimulation der CYP11A1-katalysierten Seitenkettenspaltung von Cholesterol durch die Sexualhormone Estron und Estradiol in einem rekonstituierten in vitro System. Die Aktivität von CYP11A1 bei der Hydroxylierung der vier Steroidhormone 11-Deoxycorticosteron (DOC), Androstenedion, Testosteron und Dehydroepiandrosteron (DHEA) konnte zum ersten Mal gezeigt werden. Die hydroxylierten Produkte könnten Vorläufer für interessante Pharmazeutika sein. Eine weitere wichtige Derivatisierungsreaktion von Steroiden wurde mit Hilfe der Chloramphenicolacetyltransferase I (CATI) etabliert. Dabei wirkt das Enzym in einem Escherichia coli basierten Ganzzellkatalysator als Steroidacetyltransferase. Die Ergebnisse zeigen, dass die bakterielle CATI eine zentrale Rolle bei einem neuen Ansatz zur Acetylierung von 21-Hydroxysteroiden einnimmt. Darüber hinaus wurde Pregnenolonsulfat (PregS) als Ausgangsstoff der Biosynthese sulfonierter Steroide identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das bovine CYP17 die Hydroxylierung von PregS zu 17-Hydroxypregnenolonsulfat (17-hydroxy-PregS) katalysiert. Cytochrom b5 hat keinen Einfluss auf die 17,20-Lyaseaktivität beim Umsatz von PregS durch CYP17. Für die Substratcharakterisierung in vitro wurde die Expression und Reinigung der notwendigen Proteine, bovine Cytochrom P450 Reduktase (CPR), Cytochrom b5 und CYP17, etabliert.