Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-23049
Titel: Synthese der Polyketide Flaviolin und Oxytetracyclin in permeabilisierten Zellen genetisch modifizierter Escherichia coli
Sonstige Titel: Synthesis of the polyketides flaviolin and oxytetracycline in permeabilized cells of tailored Escherichia coli
Verfasser: Krauser, Steffen
Sprache: Deutsch
Erscheinungsjahr: 2015
SWD-Schlagwörter: Polyketide
Oxytetracyclin
Biokatalyse
Escherichia coli
Freie Schlagwörter: Flaviolin
flaviolin
oxytetracycline
biocatalysis
DDC-Sachgruppe: 540 Chemie
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: In vorliegender Dissertation werden Grundlagen für die in situ Synthese von Polyketid-Sekundärmetaboliten erarbeitet. Die Verwendung permeabilisierter Escherichia coli Zellen ist ein neuartiger, vielversprechender Ansatz zur Synthese von komplexen Sekundärmetaboliten. Eine Behandlung von Zellen mit geringen Konzentrationen geeigneter Detergenzien führt dazu, dass niedermolekulare Verbindungen die Zellmembran ungehindert passieren können, während größere Biopolymere, wie z.B. Enzyme, in der Zelle verbleiben und für Synthesen genutzt werden können. Analyse und Manipulation des metabolischen Netzwerks ermöglichen darüber hinaus das Design maßgeschneiderter Biokatalysatoren. Durch Substratlimitierung können die permeabilisierten Zellen dazu genutzt werden, möglichst selektiv einzelne Biosyntheserouten zu bevorzugen. Zunächst wurde geprüft, ob es grundsätzlich möglich ist, den zellfremden Polyketid-Sekundärmetaboliten Flaviolin in permeabilisierten E. coli Zellen zu synthetisieren. Bedingungen für die Permeabilisierung der Zellmembran von E. coli BL21 wurden hierzu ermittelt und optimiert. Anhand der Anforderungen zur selektiven Synthese von Flaviolin wurde eine geeignete Syntheseroute ausgewählt. Die Syntheseroute wurde durch gezielte Überexpression von Schlüsselenzymen (Acetyl-CoA-Synthase (Acs) und Polyketid-Synthase (RppA)), sowie Deletion von Enzymen, welche unerwünschte Nebenreaktionen katalysieren (Acetat-Kinase (AckA) und Phospho-Transacetylase (Pta)), weiter optimiert. Darauf aufbauend konnte die Synthese von Oxytetracyclin (OTC) in permeabilisierten E. coli Zellen realisiert werden. Zur erfolgreichen Umsetzung der Synthese kamen modulare Versorgungssysteme für die benötigten Cofaktoren ATP, NADPH und SAM zum Einsatz, welche speziell für die Anforderungen einer Synthese mit permeabilisierten Zellen adaptiert wurden. Die Produktivität von einem Gramm des entwickelten Katalysatorgemischs, bestehend aus fünf E. coli Stämmen, beträgt 3,6∙10^(-3) nmol Oxytetracyclin pro Stunde und erreicht eine Endkonzentration von 1,88∙10^(-3) mmol/L. Für Synthesen komplexer Polyketide konnte in dieser Machbarkeitsstudie eine völlig neue Methode erschlossen werden. Eine Umsetzung in industrielle Produktionen bedarf noch weiterer Optimierung der Biokatalysatoren.
The foundations for in situ Synthesis of natural compounds, especially polyketide secondary metabolites, are subject of this thesis. Using permeabilised cells for the synthesis of complex structures is a new, promising technique. Treatment of cells with low concentrations of surfactants enables low molecular weight compounds to diffuse through the membrane, while large biopolymers, i.e. enzymes, are trapped inside the cell and can be used for syntheses. Analysis and manipulation of the metabolic network allows for the design of tailored biocatalysts. Permeabilized cells can be used to selectively address distinct biosynthetic routes by limiting the substrates. First, the synthesis of the heterologous polyketide secondary metabolite flaviolin in permeabilized cells of E. coli was tested. Conditions for successful permeabilization of the cellular membrane were determined and optimized. Synthesis routes for flaviolin were developed depending on the demand of a selective synthesis. The synthesis was further optimized by overexpression of key enzymes (acetyl-CoA synthase (Acs) and polyketide synthase (RppA)) and deletion of enzymes catalyzing undesired side reactions (acetate-kinase (AckA) and phospho-transacetylase (Pta)). Based on the results, the synthesis of oxytetracycline (OTC) could be realized in permeabilized cells of E. coli. Modular supply modules supporting the reaction were developed for the essential cofactors ATP; NADPH and SAM regarding the demands of in situ synthesis. The productivity of one gram of the biocatalyst mixture, containing of five strains of E. coli, could be determined as 3,6∙10^(-3) nmol oxytetracycline per hour, reaching a final concentration of 1,88∙10^(-3) mmol/L. For the synthesis of complex polyketide secondary metabolites, this proof of principle study reveals a completely new method. Implications in industrial processes, however, require further optimizations of the biocatalysts.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-60991
hdl:20.500.11880/23105
http://dx.doi.org/10.22028/D291-23049
Erstgutachter: Heinzle, Elmar
Tag der mündlichen Prüfung: 24-Apr-2015
SciDok-Publikation: 28-Apr-2015
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
Fachrichtung: NT - Chemie
Fakultät / Institution:NT - Naturwissenschaftlich- Technische Fakultät



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