Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-23016
Titel: The role of sulfonated steroids and parmaceutical compouds in steroid hormone biosynthesis
Sonstige Titel: Die Rolle sulfonierter Steroide und pharmazeutischer Substanzen in der Steroidhormonbiosynthese
Verfasser: Neunzig, Jens
Sprache: Englisch
Erscheinungsjahr: 2014
SWD-Schlagwörter: Steroide
Steroidderivate
Cytochrome P450
Steroidhormon
Freie Schlagwörter: CYP11A1
CYP17A1
Steroidhormonsynthese
sulfonierte Steroide
steroids
sulfonated steoids
steroid hormone biosynthesis
cytochrome P450
CYP11A1
CYP17A1
DDC-Sachgruppe: 570 Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: Steroid hormones display many regulatory functions in mammalian organisms and thus are indispensable for normal development and reproduction. They are synthesized in steroidogenic tissues, like the adrenal gland and the gonads, in a cascade of reactions, where six different steroidogenic cytochromes P450 (CYPs) participate. Investigations of compounds influencing the activity of these CYP´s are of great importance, as an altered function of the enzymes might lead to an imbalance of steroid hormones resulting in an abnormal development or metabolic disorders in mammalian organisms. In this work, investigations of the effect of sulfonated steroids and pharmaceutical compounds on steroidogenic CYPs were performed at a molecular level using purified enzymes and a cell culture system. The catalytic efficiency of the CYP11A1-dependent side-chain cleavage of cholesterol (rate-limiting step of steroid hormone biosynthesis) was shown to be strongly enhanced (75 %) in the presence of dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS), utilizing a reconstituted in-vitro system. The increased CYP11A1 activity stems from a synergistic effect exhibited by DHEAS, leading to a tighter binding of CYP11A1 with its electron transfer partner Adx and a better affinity of CYP11A1 for its substrate cholesterol. This study also revealed a positive effect of DHEAS on pregnenolone (Preg) formation, which suggests a putative physiological impact on the steroid metabolism in mammals, elucidating a new mechanism of the regulation of the steroid synthesis at cellular level. Furthermore, it was investigated whether pregnenolone sulfate (PregS), the product of the CYP11A1-dependent side-chain cleavage of cholesterol sulfate, constitutes a starting compound for a potential steroidogenic pathway for sulfonated steroids. Hence, the interaction of PregS with CYP17A1, the central enzyme of sex hormone metabolism, was examined in a reconstituted in-vitro system. It was clearly demonstrated that CYP17A1 is able to hydroxylate PregS at position C17, although no subsequent lyase-reaction could be induced in the presence of cytochrome b5. These results were confirmed by in-vivo cell culture experiments with SOAT-HEK293-cells, which were transiently transfected with plasmids encoding CYP17A1 and its redox partner NADPH-dependent oxidoreductase (CPR). Taken together, this study provides evidence that sulfonated steroids play a more important role in the steroid metabolism of mammals than previously assumed. In addition, a widely used anesthetic compound which suppresses cortisol production in humans, etomidate, and carboetomidate, a less potent etomidate derivative, were shown to interact with CYP11B1, the cortisol producing CYP. An inhibitory effect of etomidate was demonstrated in substrate conversion experiments with CYP11B1 in a reconstituted in-vitro system, as well as in cell culture. Spectroscopic studies revealed that etomidate possesses a high affinity towards recombinantly expressed and purified CYP11B1, whereas carboetomidate, which only slightly inhibits cortisol formation, did not show any affinity towards CYP11B1. In contrast to etomidate, which induces a type II-shift that is typical for inhibitors, carboetomidate does not influence the spectral properties of CYP11B1. Docking studies confirmed the inability of carboetomidate to interact with the heme iron of CYP11B1. Concluding, carboetomidate seems not to be able to enter the active site of CYP11B1, explaining the reduced inhibition of cortisol formation compared with etomidate.
Steroidhormone üben zahlreiche regulatorische Funktionen in Säugern aus und sind aus diesem Grund essentiell für eine normale Entwicklung und Fortpflanzung. Sie werden in steroidogenem Gewebe, wie der Nebenniere oder den Gonaden, in einer Reaktionskaskade, an der sechs verschiedene steroidogene Cytochrome P450 (CYPs) teilnehmen, gebildet. Die Erforschung von Stoffen, die die Aktivität dieser CYPs beeinflussen, ist von großer Bedeutung, da eine veränderte Funktion der Enzyme zu einem Ungleichgewicht der Steroidhormone führen kann, welches dann eine abnormale Entwicklung oder eine metabolische Störung zur Folge hat. In dieser Arbeit wurde der Einfluss sulfonierter Steroide sowie pharmazeutischer Substanzen auf steroidogene CYPs auf molekularer Ebene mit gereinigten Enzymen und in Zellkultur untersucht. Es wurde ein Einfluss von sulfonierten Steroiden auf die Aktivität des CYP11A1, welches den ersten enzymatischen und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Steroidhormonbiosynthese katalysiert, gefunden. Experimente in einem rekonstituierten in-vitro System zeigen, dass in Gegenwart von Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS) die katalytische Effizienz der CYP11A1-abhängigen Seitenkettenspaltung von Cholesterol um 75 % erhöht wird. DHEAS verursacht einen synergistischen Effekt, der sich in einer stärkeren Bindung des CYP11A1 an Adrenodoxin sowie einer erhöhten Affinität des CYP11A1 zu seinem Substrat Cholesterol zeigt. Zusammenfassend zeigt diese Studie einen positiven Einfluss von DHEAS auf die Pregnenolonbildung, mit einer möglichen physiologischen Relevanz für den Steroidhormonstoffwechsel in Säugern, da ein neuartiger Mechanismus zur Regulation der Steroidsynthese aufgeklärt wurde. Des Weiteren wurde untersucht, ob Pregnenolonsulfat (PregS), das Produkt der CYP11A1-abhängigen Seitenkettenspaltung von Cholesterolsulfat, eine Ausgangssubstanz für einen potentiellen steroidogenen Stoffwechselweg für sulfonierte Steroide darstellt. Daher wurde die Interaktion von PregS mit CYP17A1, einem essentiellen Enzym des Steroidmetabolismus, in einem rekonstituierten in-vitro System untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass CYP17A1 PregS an Position C17 hydroxyliert, wobei auch in Anwesenheit von Cytochrom b5 keine Lyaseaktivität induziert werden konnte. Diese Ergebnisse wurden durch in-vivo Zellkulturexperimente mit SOAT-HEK293 Zellen bestätigt, welche transient mit Plasmiden transfiziert wurden, die für CYP17A1 und seinen Elektronentransferpartner NADPH-abhängige Oxidoreduktase (CPR) kodieren. Diese zweite Studie zeigt, dass sulfonierte Steroide eine bedeutendere Rolle im Steroidmetabolismus spielen als bisher angenommen. Ferner wurde gezeigt, dass Etomidat, ein gängiges Anesthetikum, welches im Menschen die Kortisolbildung inhibiert, und Carboetomidat, ein weniger starkes Etomidatderivat, mit dem Kortisol bildenden CYP11B1 auf unterschiedliche Weise interagieren. Der inhibierende Effekt von Etomidat und Carboetomidat auf das CYP11B1 wurde sowohl in einem rekonstituierten in-vitro System, als auch in Zellkultur gezeigt. Spektroskopische Experimente enthüllten, dass Etomidat eine hohe Affinität zu CYP11B1 aufweist, wohingegen für Carboetomidat, welches die Kortisolsynthese nur schwach inhibiert, keine Affinität zum CYP11B1 nachgewiesen werden konnte. Im Gegensatz zu Etomidat, welches einen TYP II-shift induziert, der typisch für Inhibitoren ist, beeinflusst Carboetomidat nicht die spektralen Eigenschaften von CYP11B1. Dockingexperimente bestätigten die Unfähigkeit von Carboetomidat mit dem Häm-Eisen zu interagieren. Folglich scheint Carboetomidat nicht in der Lage zu sein in das aktive Zentrum des CYP11B1 zu gelangen, womit sich die geringere Inhibition der Kortisolbildung erklären lässt.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-59636
hdl:20.500.11880/23072
http://dx.doi.org/10.22028/D291-23016
Erstgutachter: Bernhardt, Rita
Tag der mündlichen Prüfung: 4-Dez-2014
SciDok-Publikation: 22-Dez-2014
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
Fachrichtung: NT - Biowissenschaften
Fakultät / Institution:NT - Naturwissenschaftlich- Technische Fakultät

Dateien zu dieser Ressource:
Datei Beschreibung GrößeFormat 
Dissertation_final5.pdf74,85 MBAdobe PDFÖffnen/Anzeigen


Alle Ressourcen in diesem Repository sind urheberrechtlich geschützt.