Transposon mutagenesis in streptomycetes

Abstract

Recent whole genome sequencing programs have revealed that the biosynthetic potential of Actinomycetales has been even underexplored with traditional approaches. With the advent of next-generation DNA sequencing techniques, we can access the huge amount of genetic information, which awaits development into new chemical and biological entities. Therefore efficient methods for the genes characterization are of great importance. In vivo transposon-based strategy is a valuable tool to identify functions of a number of genes and to construct random mutant libraries for diverse applications. Despite the wide availability of transposon systems, few options exist for use in actinomycetes. The aim of this project is to establish a system for random transposon mutagenesis in streptomycetes. According to this aim the nucleotide content of Himar1 gene was adapted to the high GC-content of streptomycetes. Set of plasmids for transposon mutagenesis had been constructed and transposon mutant libraries of streptomycetes species had been obtained (S. coelicolor M145, S. albus J1074 and S. lividans 1326). The system was used for identification of novel regulatory genes of actinorhodin biosynthesis in S. coelicolor and for random integration of gusA reporter gene and antibiotic biosynthetic cluster into chromosome of S. albus J1074 with further investigation of position effect in this strain. Also the secondary attB site, discovered in the genome of S. albus J1074, was characterized.

Die Methoden der Next-Generation DNA-Sequenzierung erlauben uns Zugang zu einer großen Menge an genetischen Informationen, die intensiv in den Bereichen der Biologie und Chemie genutzt werden sollten. Deswegen ist die Entwicklung von effektiven Methoden für eine funktionelle Gen-Charakterisierung heutzutage sehr wichtig. Die in vivo-Transposon-basierte Strategie ist ein wertvolles Instrument, das man für die Identifizierung der Funktionen zahlreicher Gene und die Konstruktion von Random-Mutanten-Bibliotheken für vielfältige Anwendungen nutzen kann. Trotz der breiten Verfügbarkeit von Transposon-Systemen sind nur wenige davon zuverlässig auf Streptomyceten anwendbar. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein System für Random-Transposon-Mutagenese in Streptomyceten zu entwickeln. Hierfür wurde der Codongebrauch des Himar1 Gens an den hohen GC-Gehalt der Streptomyceten angepasst. Basierend auf diesem Gen wurden die Plasmide für die Transposon-Mutagenese konstruiert und die Bibliotheken der Mutanten von verschiedenen Streptomyceten erzeugt. Das System wurde in S. coelicolor für die Identifizierung von neuen regulatorischen Genen in der Actinorhodin Biosynthese verwendet. Außerdem wurden mit Hilfe unseres Systems das Reporter-Gen gusA und biosynthetische Antibiotika-Cluster zufällig in das S. albus-Chromosom integriert. Damit wurde der Positions-Effekt in diesem Stamm erforscht. Es wurde auch eine sekundäre attB-Stelle von fC31-basierten Plasmiden entdeckt und charakterisiert.