Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-22954
Titel: Metabolic studies on Schizosaccharomyces pombe for improved protein secretion
Verfasser: Klein, Tobias
Sprache: Englisch
Erscheinungsjahr: 2013
SWD-Schlagwörter: Proteinsekretion
Hefeartige Pilze
Stoffwechsel
Freie Schlagwörter: Metabolische Flussanalyse
Schizosacchromyces pombe
protein secretion
metabolic flux analysis
DDC-Sachgruppe: 570 Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: The fission yeast Schizosaccharomyces pombe is an attractive host for heterologous protein secretion but currently still too little developed to compete against industrial cell factories like Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisiae. Thus, the present work aimed at increasing the understanding of the metabolism of S. pombe and the metabolic burden associated with protein secretion in order to derive metabolic engineering strategies for improving recombinant protein production. In the first part a system of small-scale parallel bioreactors was constructed to perform studies in continuous culture. This system was used for quantitative metabolic analyses applying 13C-based metabolic flux analysis to S. pombe grown on mixtures of glycerol and acetate compared to respiratory growth on glucose as sole carbon source. Next the methttp://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/incoming/2014/5760/abolic burden of protein secretion was investigated, using strains secreting the model protein maltase in varying amounts up to 27 mg per g cells. Quantitative analysis of the metabolic fluxes and the macromolecular cell composition revealed that lipid biosynthesis, TCA cycle and supply of mitochondrial NADPH as bottlenecks in protein secretion. From these data, a feeding strategy was derived for supplementing the media with acetate and glycerol, which enabled the cells to overcome these limitations. The results were transferred to heterologous secretion of GFP and a single-chain antibody fragment, increasing yields 2-fold and 4-fold, respectively.
Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe stellt ein attraktives System zur heterologen Proteinsekretion dar, kann derzeit aber noch nicht mit Zellfabriken wie Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae konkurrieren. Diese Arbeit sollte daher das Verständnis des Metabolismus von S. pombe und dessen Belastung durch Sekretion von Proteinen vergrößern, um Strategien für das Metabolic Engineering abzuleiten, welche die rekombinanten Proteinproduktion verbessern. Zunächst wurde ein System paralleler Bioreaktoren aufgebaut, um Studien in kontinuierlicher Kultur durchzuführen. In diesem System wurden quantitative metabolische Analysen an S. pombe mittels 13C basierter metabolischer Flussanalyse auf Gemischen aus Glycerin und Acetat durchgeführt und mit dem respirativen Wachstum auf Glucose verglichen. Weiter wurde die Belastung des Metabolismus durch Sekretion des Modellproteins Maltase untersucht. Eine quantitative Analyse der metabolischen Flüsse und der makromolekularen Zellzusammensetzung zeigte, dass die Lipid-Biosynthese, der Citratzyklus und die Bereitstellung von mitochondriellem NADPH Engpässe in der Proteinsekretion darstellen. Hieraus wurden Fütterungsstrategien abgeleitet und das Medium mit Acetat und Glycerin supplementiert, wodurch diese Limitierungen überwunden werden konnten. Diese Strategien wurden auf die heterologe Sekretion von GFP und einem Antikörper-Fragment übertragen, wodurch deren Ausbeuten um das 2-fache und 4-fache gesteigert werden konnten.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-57607
hdl:20.500.11880/23010
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22954
Erstgutachter: Heinzle, Elmar
Tag der mündlichen Prüfung: 16-Apr-2014
SciDok-Publikation: 24-Apr-2014
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
Fachrichtung: NT - Chemie
Fakultät / Institution:NT - Naturwissenschaftlich- Technische Fakultät

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