Charakterisierung ausgewählter Cytochrome P450 aus Sorangium cellulosum So ce56 : neue potentielle Biokatalysatoren

Abstract

Cytochrome P450 erfreuen sich in den letzten Jahren immer größerer Beliebtheit als Biokatalysatoren, da sie den Einbau von atomarem Sauerstoff in nicht aktivierte C-H-Bindungen katalysieren. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Charakterisierung der P450 CYP109D1, CYP260A1, CYP260B1, CYP264A1 und CYP266A1 aus S. cellulosum So ce56. Hierfür wurden die P450 in E. coli rekombinant exprimiert und mögliche Substrate wurden mit den gereinigten Enzymen identifiziert. Um für die anschließende Produktcharakterisierung ausreichende Produktmengen herzustellen, wurde ein universell einsetzbares E. coli Ganzzellsystem etabliert, bei dem das jeweilige P450 mit einem heterologen Redoxsystem, bestehend aus Adrenodoxinreduktase (AdR) und Adrenodoxin (Adx), coexprimiert wurde. Dieses System konnte durch den Austausch der schwer exprimierbaren AdR durch die E. coli eigene Reduktase (Fpr) entscheidend optimiert werden. Gleichzeitig wurde durch den erstmaligen Einsatz des M9CA-Mediums die endogene Bildung von Indol und die daraus resultierende Inhibition der P450 Biotransformationen verhindert. Mit dem CYP260A1-abhängigen Ganzzellsystem wurden 9 Steroide erfolgreich umgesetzt und die Produkte anschließend isoliert und charakterisiert. Interessanterweise stellte sich heraus, dass es sich bei CYP260A1 um die erste beschriebene 1α-Steroidhydroxylase handelt, mit der es möglich ist, bislang noch nicht bekannte Steroidderivate herzustellen.

In the last years, Cytochromes P450 have become more and more popular as biocatalysts due to their ability to introduce molecular oxygen into non-activated C-H bonds. This work is concerned with the characterization of the P450s CYP109D1, CYP260A1, CYP260B1, CYP264A1 and CYP266A1 from Sorangium cellulosum So ce56. For this purpose, the P450s were recombinantly expressed in E. coli and the purified enzymes were used to identify po-tential substrates. In order to obtain sufficient quantities of product for structural characteriza-tion, a universally applicable E. coli whole-cell system was established, in which the respective P450 was co-expressed with a heterologous redox system consisting of adrenodoxin reductase and adrenodoxin. This system could be significantly enhanced by the exchange of the badly expressable AdR by the E. coli own reductase (Fpr). With the first-time application of M9CA medium the endogenous indole synthesis and its inhibitory effect on the P450 bio-transformations could be suppressed. Using this whole-cell system; the products of the CYP260A1 dependent biotransformations from 9 steroids could be isolated and character-ized. Interestingly, CYP260A1 was shown to act as a 1α-steroidhydroxylase. Thus, CYP260A1 is a promising candidate for biotransformations aiming at the production of hith-erto unknown steroid derivatives.