Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for L-lysine production on silage

Abstract

Currently the essential amino acid L-lysine is mostly produced using traditional substrates like glucose and molasses. In this work, a computer based approach and molecular biology techniques were applied in order to investigate the potential of L-lysine overproduction with C. glutamicum on renewable substrates, in this case silage and silage juice. Based on elementary mode analysis, several target genes in the feedback resistant C. glutamicum lysCfbr strain, including D-lactate dehydrogenase (dld), pyruvate carboxylase (pyc), malic enzyme (malE), fructose 1,6-bisphosphatase (fbp) and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (gapX), were overexpressed. Substantially re–designing the metabolism yielded mutants with good growth characteristics, complete substrate consumption, reduced byproduct formation coupled with increasing L-lysine yields on synthetic and natural silage juices. This combination of mutations, beneficial for the use of gluconeogenic substrates and sufficient anabolic reduction power, yielded a robust and stable strain, C. glutamicum SL. With a total L-lysine carbon yield of around 10% at growth rates of µ = 0.35 ± 0.01 h-1 on grass and corn silage juices with no further supplementation and hardly affected by low oxygen supply, this strain proves the suitability of bio-based L-lysine production.

Für die Produktion der essentiellen Aminosäure L-Lysin wurden bisher traditionelle Kohlenstoffquellen wie Glukose und Molasse benutzt. Unter Zuhilfenahme bioinformatischer und molekularbiologischer Methoden wurde die Einsatzmöglichkeit von Silage und Silagepresssaft als Fermentationssubstrat für eine Lysinproduktion mit C. glutamicum geprüft. Basierend auf der durchgeführten Elementarmodenanalyse wurden im Ausgangsstamm C. glutamicum lysCfbr die D-Laktat Dehydrogenase (dld), Pyruvatcarboxylase (pyc), Malatenzym (malE), Fruktose-1,6–bisphosphatase (fbp) und die Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (gapX) überexprimiert. Die Umstrukturierung des Zentralstoffwechsels lieferte Mutanten mit guten Wachstumsraten, einem breiteren Substratspektrum, geringerer Nebenproduktbildung und erhöhten Lysinausbeuten auf synthetischen und natürlichen Silagepresssäften. Durch die Kombination an Mutationen, die eine bessere Verwertung von glukoneogenen Substraten und eine ausreichende NADPH Versorgung ermöglicht, entstand der robuste und stabile Stamm C. glutamicum SL. Mit Lysinausbeuten von 10% bei einer Wachstumsrate µ = 0.35 ± 0.01 h-1 auf verschiedenen Silagepresssäften auch bei reduzierter Sauerstoffversorgung, zeigt dieser Stamm ein großes Potential für Lysinproduktion auf Silagen als nachwachsendem Rohstoff.