Please use this identifier to cite or link to this item: doi:10.22028/D291-22767
Title: Etablierung einer Biotransformation zur stereoselektiven Hydroxylierung der Sulfonylharnstoffe Glimepirid und Glibenclamid sowie von Vitamin D3 mit CYP105A1
Other Titles: Establishment of a biotransformation for stereoselective hydroxylation of sulfonylureas glimepiride and glibenclamide and vitamin D3 using CYP105A1
Author(s): Kleser, Michael Werner
Language: German
Year of Publication: 2011
SWD key words: Sulfonylharnstoffderivate
Vitamin D3
Biokonversion
Cyclodextrine
Cytochrom P-450
Free key words: Sulfonylharnstoff
Ganzzellsystem
sulfonylurea
whole-cell system
DDC notations: 570 Life sciences, biology
Publikation type: Doctoral Thesis
Abstract: CYP105A1 aus Streptomyces griseolus gehört zur Superfamilie der Cytochrom P450-Enzyme und verfügt über ein großes biotechnologisches Potential. Da das natürliche Redoxsystem des P450-Enzyms nicht vollständig aufgeklärt ist, wurden alle CYP105A1 Reaktionen in vitro bislang mithilfe eines Elektronentransfersystems aus Spinacia oleracea durchgeführt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein alternatives Redoxsystem, bestehend aus einer Mutante des Ferredoxins Etp1fd, Etp1fd (516-618) und der zugehörigen Ferredoxin-Reduktase Arh1 aus der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe, etabliert werden. Als CYP105A1-Substrate wurden neben Vitamin D3 die Sulfonylharnstoffe (SUs) Glimepirid und Glibenclamid untersucht. Die kinetischen Parameter der SU-Reaktionen wurden bestimmt und die Strukturen der Reaktionshauptprodukte aufgeklärt. Die Orientierung von Glimepirid und Glibenclamid im aktiven Zentrum von CYP105A1 wurde mit einem Computer-Docking-Modell gezeigt. Des Weiteren wurden Ganzzellsysteme zur effizienten 3-Hydroxylierung der SU-Substrate und der 25-Hydroxlierung von Vitamin D basierend auf Bacillus megaterium MS941 entwickelt. Im Zuge der Optimierung zeigte sich, dass der Wirtsstamm über ein zu CYP105A1 kompatibles Elektronentransfersystem verfügt. Neben Studien zur Steigerung der heterologen Proteinexpression wurden auch Untersuchungen zur Steigerung der Bioverfügbarkeit und der Membranpermeabilität der verwendeten Substrate durchgeführt.
CYP105A1 from Streptomyces griseolus belongs to the superfamily of cytochrome P450 enzymes and shows great biotechnological potential. For in vitro studies so far all CYP105A1 reactions have been performed using a reconstituted electron transfer system from Spinacia oleracea, because the natural redox system has not yet been completely elucidated. In this work an alternative redox chain consisting of a mutant of the ferredoxin Etp1fd, Etp1fd (516-618) and the ferredoxin reductase Arh1 from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe was established. Apart from Vitamin D3, the sulfonylurea substrates (SUs) glimepiride and glibenclamide were used both in in vitro and in vivo conversions. The kinetic parameters of SU reactions were determined and the structures of the main products were solved by NMR. Moreover, the orientation of glimepiride and glibenclamide in the active site of CYP105A1 was demonstrated by a docking model. Subsequently, a whole cell bioconversion system based on Bacillus megaterium MS941 was developed for the efficient 3-hydroxylation of SU-substrates and 25-hydroxylation of Vitamin D3. Interestingly, it was found that Bacillus megaterium provides a compatible electron transfer system for CYP105A1. In addition to studies to optimize heterologous protein expression, several options to improve the bioavailability and membrane permeability of the respective substrates were probed.
Link to this record: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-45748
hdl:20.500.11880/22823
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22767
Advisor: Bernhardt, Rita
Date of oral examination: 22-Dec-2011
Date of registration: 18-Jan-2012
Faculty: NT - Naturwissenschaftlich- Technische Fakultät
Department: NT - Biowissenschaften
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