Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-22767
Titel: Etablierung einer Biotransformation zur stereoselektiven Hydroxylierung der Sulfonylharnstoffe Glimepirid und Glibenclamid sowie von Vitamin D3 mit CYP105A1
Sonstige Titel: Establishment of a biotransformation for stereoselective hydroxylation of sulfonylureas glimepiride and glibenclamide and vitamin D3 using CYP105A1
Verfasser: Kleser, Michael Werner
Sprache: Deutsch
Erscheinungsjahr: 2011
SWD-Schlagwörter: Sulfonylharnstoffderivate
Vitamin D3
Biokonversion
Cyclodextrine
Cytochrom P-450
Freie Schlagwörter: Sulfonylharnstoff
Ganzzellsystem
sulfonylurea
whole-cell system
DDC-Sachgruppe: 570 Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: CYP105A1 aus Streptomyces griseolus gehört zur Superfamilie der Cytochrom P450-Enzyme und verfügt über ein großes biotechnologisches Potential. Da das natürliche Redoxsystem des P450-Enzyms nicht vollständig aufgeklärt ist, wurden alle CYP105A1 Reaktionen in vitro bislang mithilfe eines Elektronentransfersystems aus Spinacia oleracea durchgeführt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein alternatives Redoxsystem, bestehend aus einer Mutante des Ferredoxins Etp1fd, Etp1fd (516-618) und der zugehörigen Ferredoxin-Reduktase Arh1 aus der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe, etabliert werden. Als CYP105A1-Substrate wurden neben Vitamin D3 die Sulfonylharnstoffe (SUs) Glimepirid und Glibenclamid untersucht. Die kinetischen Parameter der SU-Reaktionen wurden bestimmt und die Strukturen der Reaktionshauptprodukte aufgeklärt. Die Orientierung von Glimepirid und Glibenclamid im aktiven Zentrum von CYP105A1 wurde mit einem Computer-Docking-Modell gezeigt. Des Weiteren wurden Ganzzellsysteme zur effizienten 3-Hydroxylierung der SU-Substrate und der 25-Hydroxlierung von Vitamin D basierend auf Bacillus megaterium MS941 entwickelt. Im Zuge der Optimierung zeigte sich, dass der Wirtsstamm über ein zu CYP105A1 kompatibles Elektronentransfersystem verfügt. Neben Studien zur Steigerung der heterologen Proteinexpression wurden auch Untersuchungen zur Steigerung der Bioverfügbarkeit und der Membranpermeabilität der verwendeten Substrate durchgeführt.
CYP105A1 from Streptomyces griseolus belongs to the superfamily of cytochrome P450 enzymes and shows great biotechnological potential. For in vitro studies so far all CYP105A1 reactions have been performed using a reconstituted electron transfer system from Spinacia oleracea, because the natural redox system has not yet been completely elucidated. In this work an alternative redox chain consisting of a mutant of the ferredoxin Etp1fd, Etp1fd (516-618) and the ferredoxin reductase Arh1 from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe was established. Apart from Vitamin D3, the sulfonylurea substrates (SUs) glimepiride and glibenclamide were used both in in vitro and in vivo conversions. The kinetic parameters of SU reactions were determined and the structures of the main products were solved by NMR. Moreover, the orientation of glimepiride and glibenclamide in the active site of CYP105A1 was demonstrated by a docking model. Subsequently, a whole cell bioconversion system based on Bacillus megaterium MS941 was developed for the efficient 3-hydroxylation of SU-substrates and 25-hydroxylation of Vitamin D3. Interestingly, it was found that Bacillus megaterium provides a compatible electron transfer system for CYP105A1. In addition to studies to optimize heterologous protein expression, several options to improve the bioavailability and membrane permeability of the respective substrates were probed.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-45748
hdl:20.500.11880/22823
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22767
Erstgutachter: Bernhardt, Rita
Tag der mündlichen Prüfung: 22-Dez-2011
SciDok-Publikation: 18-Jan-2012
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
Fachrichtung: NT - Biowissenschaften
Fakultät / Institution:NT - Naturwissenschaftlich- Technische Fakultät

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