Die Methode der Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung zur Analyse von HIV- und SIV-Genomen auf Einzelzellebene

Abstract

HIV zeichnet sich durch eine hohe genetische Variabilität aus. Die fehlerbehaftete Replikation stellt ein wesentliches Charakteristikum und die Grundlage für die Pathogenität dar. Um Einblicke in grundlegende Veränderungsmechanismen von HIV zu gewinnen, ist eine Analyse auf Ebene einzelner infizierter Zellen von Patienten notwendig. Die HIV-spezifische FISH spielt bei den Untersuchungen auf Einzelzellebene eine entscheidende Rolle. In dieser Arbeit konnte sowohl die RNA-FISH als auch die DNA-FISH erfolgreich etabliert und optimiert werden. Mit Hilfe beider Methoden gelang es, Patientenmaterial bezüglich der Zahl produktiv-infizierter Zellen und der Provirus-Kopienzahl zu analysieren. In einzelnen Zellen aus lymphatischen Geweben von SIV-infizierten Rhesus Makaken wurden von der Primärvirämie bis zum späten Stadium der Infektion zwei bis drei provirale SIV-Sequenzen spezifisch detektiert. Der Nachweis der Mehrfachinfektion in einzelnen MNC aus der Milz eines Rhesusaffens zwei Wochen nach Beginn der Infektion zeigte, dass der Grundstein zur Steigerung der Variantenvielfalt über Rekombinationsereignisse in der frühen Phase der Infektion gelegt wird. Die Bestimmung multipler Proviren während des gesamten Infektionsverlaufs demonstriert, dass dieser Prozess als ein kontinuierlich stattfindendes Ereignis während des Infektionsgeschehens anzusehen ist. Diese Daten dienen nun als Basis mathematischer Modellrechnungen zur HIV-Evolution.

The pathogenic retrovirus HIV is characterized by a high genetic diversity, which is induced by different error processes. To get detailed insights into mechanisms that contribute to the genetic variants, the analysis of single infected cells of HIV-positive patients is essential. The HIV-specific FISH is of great importance for analysing HIV-infection on the single cell level. In the present work, the technical improvement of both, the HIV-specific RNA-FISH and the HIV-specific DNA-FISH, was successful. Using both techniques, productively infected cells and the provirus copy number in patient material could be determined. With the help of the SIV-specific DNA-FISH, two or three integrated proviral SIV-sequences were detected in single splenocytes of SIV-infected rhesus macaques from the primary viremia to the late stage of infection. The detection of multiple proviruses within single cells two weeks post infection shows that the increase of genetic diversity via recombination begins in the primary stage of infection. Furthermore, the detection of multiinfection in single cells during the complete course of infection demonstrates that recombination is a dominant continuous mechanism for generating new virus variants. These results will be incorporated as fundamental parameters in a mathematical model for simulating HIV-evolution.