Development of efficient cytochrome P450-dependent whole-cell biotransformation reactions for steroid hydroxylation and drug discovery

Abstract

Cytochromes P450 play a vital role in the steroid biosynthesis in the human adrenal gland, e.g. the production of hydrocortisone and aldosterone by CYP11B1 and CYP11B2, respectively. The steroid hydroxylases of the CYP11B family are important targets for drug development. Since they are very closely related, the discovery of selective inhibitors has been a focus of interest. Furthermore, hydrocortisone is a precursor for drugs with high therapeutic potential. Therefore, the purpose of this work was the development of an efficient system for CYP11B-dependent whole-cell biotransformation to facilitate the bioproduction of hydrocortisone and the discovery of selective inhibitors. The present work shows clearly that hydrocortisone production can be dramatically enhanced (3.4-fold) by coexpression of the natural redox partners of CYP11B1. Moreover, a high production efficiency has been achieved by optimisation of the reaction conditions. Additionally, in the course of this work an automated screening technology plate-format has been developed using a CYP11B2-expressing fission yeast strain. Additionally, the conditions for HPLC analysis of steroids were optimised and a high throughput screening system for the discovery of CYP11B2 inhibitors has been established. The new screening system was successfully used for the investigation of a library of pharmacologically active compounds resulting in the identification of several novel potential inhibitors of CYP11B2.

Cytochrome P450 spielen eine entscheidende Rolle in der Steroidbiosynthese in der menschlichen Nebenniere z. B. bei der Produktion von Hydrocortison durch CYP11B1 sowie von Aldosteron durch CYP11B2. Steroidhydroxylasen der CYP11B Familie stellen Ziele für die Entwicklung von Medikamenten dar. Wegen des hohen Verwandtschaftsgrades dieser Enzyme ist die Entdeckung selektiver Inhibitoren von großem Interesse. Darüber hinaus ist Hydrocortison eine Vorstufe für Arzneimittel mit großem therapeutischem Potenzial. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Entwicklung eines effizienten Systems für die CYP11B-abhängige Ganzzellbiotransformation, um die Herstellung von Hydrocortison sowie die Identifizierung selektiver CYP11B2-Inhibitoren zu erleichtern. Die Hydrocortisonproduktion konnte in dieser Arbeit durch die Coexpression der natürlichen Redoxpartner von CYP11B1 und durch die Optimierung der Reaktionsbedingungen deutlich gesteigert werden. Für den Nachweis von selektiven CYP11B2-Inhibitoren wurde für die Spalthefe ein automatisches hintergrundarmes Hochdurchsatz-Screening-System, basierend auf Mikrotiterplatten und HPLC-Analyse entwickelt. Dieses Verfahren wurde anschließend erfolgreich für die Untersuchung einer Bibliothek pharmakologisch aktiver Komponenten benutzt, wobei neue potentielle Inhibitoren detektiert wurden.