Endozytose, Retrotranslokation und Ubiquitinierung des viralen K28-Toxins der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Abstract

K28-Killerstämme der Hefe S. cerevisiae sezernieren ein nicht-glykosyliertes Protein-Toxin, das über Endozytose und retrograden Transport durch den Sekretionsweg in sensitive Hefen eindringt. Im Rahmen dieser Arbeit wird gezeigt, dass es sich bei dem sekundären Membranrezeptor des K28-Toxins um den HDEL-Rezeptor Erd2p handelt. Als Endozytosesignal fungiert, neben der NPF-Sequenz im Plasmamembranrezeptor Erd2p, auch eine Markierung durch Ubiquitin, die durch das Ubiquitin-konjugierende Enzym Ubc4p und die Ubiquitin-Protein- Ligase Rsp5p erfolgt. Es wird dargestellt, dass die Aufnahme des viralen K28-Toxins durch einen Clathrin- und Aktin-vermittelten Prozess unter Beteiligung des AP2- Komplexes erfolgt. Desweiteren wird demonstriert, dass die Proteindisulfid-Isomerase Pdi1p essentiell für den Toxin-Export aus dem ER in das Zytosol einer sensitiven Zelle ist. An der Retrotranslokation beteiligt sind ebenfalls die ER-lumenalen Chaperone Scj1p und Jem1p. Der Transport des K28-Toxins aus dem ER ist ebenso abhängig von der Ca2+-Konzentration im Sekretionsweg der Hefe. Eine Beteiligung des Cdc48/Ufd4p/Npl1p-Komplexes und des Proteasoms am Export von K28 aus dem ER in das Zytosol kann ausgeschlossen werden. Eine komplett Lysin-freie Toxinvariante wies eine unveränderte invivo- Abtötungs-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-Toxin auf. Die Retrotranslokation des K28-Toxins erfolgt deshalb unabhängig von einer Ubiquitinierung.

K28 killer strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae secrete a nonglycosylated protein toxin that traverses sensitive yeast cells by endocytosis and retrograde transport through the secretory pathway. Here it is demonstrated that the secondary membrane receptor of K28 toxin has very recently been identified as the HDEL receptor Erd2p. Within the sequence of the plasma membrane receptor Erd2p, the motive NPF acts as an endocytosis signal, as well as an ubiquitination mediated by the ubiquitinconjugation enzyme Ubc4p and the ubiquitin-protein-ligase Rsp5p. It is shown that the endocytosis of the virally encoded K28 toxin is based on a clathrin- and actin-mediated process in cooperation with the AP2 complex. Within this thesis the function of the protein disulfid isomerase is shown to be essential for the export of K28 from the ER to the cytosol of a sensitive yeast cell. In additon, the ER lumenal chaperones Scj1p and Jem1p play an important role in toxin retrotranslocation. The transport of K28 out of the ER is also dependent on the Ca2+-concentration in the secretory pathway of a yeast cell. An involvement of the Cdc48/Ufd4p/Npl1p complex and the proteasom in retrotranslocation of K28 can be excluded. A toxin variant in which all four lysin residues had been converted to arginine showed almost identical in vivo killing activity as the wild-type toxin. Retrotranslocation of the K28 toxin is therefore independent of ubiquitination.