Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-22341
Titel: MALDI mass spectrometry and ionic liquids-applications in functional protein analysis
Sonstige Titel: MALDI-Massenspektrometrie und Ionische Flüssigkeiten-Anwendungen in der funktionellen Proteinanalytik
Verfasser: Zabet-Moghaddam, Masoud
Sprache: Englisch
Erscheinungsjahr: 2006
SWD-Schlagwörter: MALDI-MS
Freie Schlagwörter: MALDI-MS
ionic liquids
DDC-Sachgruppe: 540 Chemie
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: The use of ionic liquids as matrices for matrix assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) was investigated. Traditionally used ionic liquids are unsuitable as matrices in MALDI analysis. A new class of ionic liquids was explored, the so-called ionic liquid matrices (ILMs) that show great promise as matrices. ILMs are equimolar mixtures of solid MALDI-matrices, 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CCA), sinapinic acid (SA) or indoleacrylic acid (InAA) with organic bases. These allowed the formation of a thin liquid layer on the target having negligible vapour pressure. The main advantage of using ILMs was found in remarkable enhancement in sample homogeneity leading to increase spot-to-spot and shot-to-shot reproducibility. The ILMs were used for the analysis of low molecular weight compounds such as amino acids, sugars and vitamins, and also large biomolecules like peptides and proteins. The high sample homogeneity achieved using ILMs facilitated the measurement by eliminating the laborious searching for the analyte on the target spot. In conjugation with the use of a proper internal standard, the relative quantification of amino acids was improved using ILM when compared to using crystallized matrixes. An additional advantage was the significantly reduced measurement time in an automated measurement. The ability of ILMs to perform quantification of peptides and proteins without using internal standards was also investigated. It was found that there is a linear correlation between the amount of analyte on the target and their signal intensities when increased molar matrix-toanalyte ratios are used. The dynamic range of linearity was about one order of magnitude. The method was further applied successfully for screening of the trypsin-catalyzed reaction of single peptide. Moreover, semi-quantitative monitoring of multi-substrate (peptide mixtures) cleavage catalyzed by trypsin was shown. Pyridinuim-based ILM in substoichiometric amount of pyridine (Py) with CCA (molar ratio of CCA:Py = 2:1) improved the measurement of peptides compared to using CCA in terms of signal-to-noise ratios, reduction of chemical noise and reduced formation of alkali adducts and matrix-clusters. This optimized ILM was used for the measurement of tryptic in-solution as well as in-gel digests of the model proteins. As a result, the identification of proteins by peptide mass fingerprint (PMF) was facilitated compared to using CCA in database search engine, yielding higher scores and increased sequence coverage. In the second part of work, MALDI-MS was applied for the characterization of five different ionic liquids and the analysis of amino acids, peptides and proteins dissolved in ionic liquids. The ionic liquids were characterized both by laser desorption/ionization (LDI) and by MALDI-MS. The signals of both cations and anions of ionic liquids could be observed in both methods. In the latter case, adduct formations between cations and anions of ionic liquids were identified. Analysis of the amino acids, peptides and proteins dissolved in ionic liquids could be performed after addition of matrix molecules. Interestingly, no sodium or potassium adducts could be observed for any analyte tested here. Typically, low molecular weight compounds and peptides could be analyzed better in water-immiscible ionic liquids whereas proteins gave the better results in water-miscible ionic liquids. The homogeneity of samples was reduced in the presence of ionic liquids when compared to classical MALDI preparations. However relative quantification of amino acids using isotope-labeled internal standard was possible. Thus D-amino acid oxidative reaction catalyzed by D-amino acid oxidase which was carried out in ionic liquids could be monitored by MALDI-MS. In the last part of work basic MALDI mechanistic principles by the use of ILMs was investigated and theoretical aspects of ion formation in the presence of ionic liquids both in LDI and MALDI analysis are discussed.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Anwendung von ionischen Lösungen als Matrix für die Matrix unterstützte Laser-Desorption/Ionisation (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Mass Spectrometry; MALDI-MS) untersucht. Da die traditionellen ionischen Lösungen als Matrix für MALDI Analysen unbrauchbar sind, wurde hier eine neue Klasse von Ionischen Lösungen untersucht, die so genannten Ionic Liquid Matrices (ILMs). ILMs sind equimolare Mixturen von festen MALDI Matrizes, wie etwa 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB), a-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CCA), 3-Hydroxy-4-methoxyzimtsäure (Sinapinic Acid; SA) oder 3-(1-H-Indol-3-yl)-2-propionsäure (Indoleacrylic Acid; InAA), mit organischen Basen. Diese Anwendung ermöglichte die Ausbildung von dünnen Schichten der Lösungen auf der Probenplatte mit vernachlässigbarem Dampfdruck. Der hauptsächliche Vorteil in der Nutzung von ILMs verdeutlichte sich in der bemerkenswerten Verbesserung der Probenhomogenität und in einer erhöhten spot-to-spot und shot-to-shot Reproduzierbarkeit. Die ILMs wurden für die Analyse von Komponenten mit niedrigen molekularen Massen, wie etwa Aminosäuren, Zuckern und Vitaminen, aber auch von grossen Biomolekülen, wie Peptide und Proteine benutzt. Die durch die Anwendung von ILMs erhaltene hohe Probenhomogenität erleichterte die Messungen durch die Eliminierung der mühsamen Suche nach den Analyten auf den Spots der Probenplatte. Im Vergleich zu kristallisierten Matrizes konnte durch die Anwendung von ionischen Lösungen mit geeigneten internen Standards die relative Quantifizierung von Aminosäuren verbessert werden. Ein zusätzlicher Vorteil in dieser Methodik war die signifikante Reduzierung der Messdauer bei automatisierten Messungen.Des Weiteren wurde die Eignung von ILMs untersucht um Peptide und Proteine ohne interne Standards zu quantifizieren. Hierbei zeigte sich dass die Menge des Analyts auf der Probenplatte mit den Signalintensitäten linear korreliert, nachdem erhöhte molare Matrix:Analyt Verhältnisse benutzt wurden. Der dynamische Bereich der Linearität betrug hierbei eine Zehnerpotenz. Diese Methode wurde des Weiteren erfolgreich zum Screening von Trypsin katalysierten Reaktionen von einzelnen Peptiden benutzt und darüber hinaus ebenfalls zur semi-quantitativen Kontrolle von Multi-Substrat (Peptid Mixturen) Verdau durch Trypsin. Auf Pyridinium basierte ILMs mit substöchiometrischen Mengen von Pyridin (Py) und CAA (CCA:Py=2:1) verbesserten die Messungen von Peptiden bezüglich des Signal-Rausch Verhältnisses, der Reduktion des chemischen Rauschen und der Reduktion von Alkali Addukt-Bildung und Matrix-Clustern im Vergleich zu Messungen nur mit CCA. Diese optimierten ILMs wurden für die Messung von tryptischen Spaltungen in Lösung wie auch In-Gel-Trypsinisierungen von Modell-Proteinen benutzt. Es konnte gezeigt werden, dass im Vergleich zu CCA die Identifikation der Proteine durch Peptide Mass Fingerprint (PMF) per Datenbanksuche deutlich verbessert wurde. Im Detail konnten höhere Score's in der Datenbanksuche und eine erhöhte Sequenzabdeckung erreicht werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde MALDI-MS zur Charakterisierung von fünfunterschiedlichen ionischen Lösungsmitteln und der Analyse von in ionischen Lösungsmitteln gelösten Aminosäuren, Peptiden und Proteinen untersucht. Die ionischen Lösungsmitteln wurde sowohl durch Laser Desorbtion/Ionisation (LDI) als auch per MALDIMS charakterisiert. Die Signale der Kationen und Anionen der ionischen Lösungsmittel konnten durch beide Methoden verfolgt werden. Im letzteren Fall konnte die Bildung von Addukten zwischen den Kationen und Anionen der ionischen Lösungsmittel beobachtet werden. Die Zugabe von Matrix-Molekülen erlaubte die Analyse von in ionischen Lösungsmittel gelösten Aminosäuren, Peptiden und Proteinen. Bei keinem der getesteten Analyten konnten interessanterweise Natrium- oder Kalium-Addukte nachgewiesen werden. Typischerweise konnten Komponenten mit niedrigen molekularen Massen und Peptide in Wasser abweisenden ionischen Lösungsmittel analysiert werden. Im Vergleich zur klassischen MALDI Probenpräparation war die Homogenität der Proben in der Anwesenheit von ionischen Lösungsmittel verringert. Nichtsdestotrotz war eine relative Quantifizierung von Aminosäuren mit Hilfe von isotopisch markierten internen Standards möglich. Folglich konnten durch D-Aminosäureoxidase katalysierte oxidative Reaktionen von D-Aminosäuren mit MALDI-MS verfolgt werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden grundsätzliche mechanistische Prinzipien der MALDI in der Anwendung von ILMs untersucht und theoretische Aspekte der Ionenbildung in Anwesenheit von ionischen Lösungsmitteln sowohl in der LDI als auch MALDI diskutiert.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-8026
hdl:20.500.11880/22397
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22341
Erstgutachter: Heinzle, Elmar
Tag der mündlichen Prüfung: 13-Nov-2006
SciDok-Publikation: 23-Nov-2006
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
Fachrichtung: NT - Chemie
Fakultät / Institution:NT - Naturwissenschaftlich- Technische Fakultät

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