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Titel: Untersuchungen zum Protein-Koimport von Katalase A in Peroxisomen und Mitochondrien in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
Sonstige Titel: Investigations of the protein coimport of catalase A into peroxisomes and mitochondria in the yeast Saccharomyces cerevisiae
Verfasser: Drescher, Diane
Sprache: Deutsch
Erscheinungsjahr: 2006
SWD-Schlagwörter: Katalase
Mitochondrium
Peroxisom
Oxidativer Stress
Freie Schlagwörter: catalase
mitochondria
peroxisome
yeast
oxidative stress
DDC-Sachgruppe: 570 Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des dualen Targetings von Katalase A in Peroxisomen und Mitochondrien der Hefe S. cerevisiae. Mit Hilfe einer CTA-GFP-Fusion, in der GFP am Carboxyterminus von Cta1p vorliegt, wurden sowohl mit immunochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Nachweismethoden, als auch mit Enzymaktivitätstests Hinweise auf eine mitochondriale Lokalisation von Cta1p erhalten. Die Beeinflussung der Zielsteuerung von Cta1p in der Zelle durch GFP, welches das PTS1-Signal am Carboxyterminus von Cta1p maskiert, wurde in mehreren Versuchen ausgeschlossen: Durch Konstruktion von CTA-GFP-Derivaten, welche C-terminal um die sechs terminalen Aminosäuren SSNSKF von Cta1p erweitert wurden, sowie durch Herstellung einer c-myc-"getaggten"-CTA-Variante konnten sowohl das korrekte peroxisomale Targeting, als auch das Ausbleiben eines Misstargeting in andere Organellen gezeigt werden. Zellfraktionierungsexperimente mit anschließendem immunochemischen Nachweis von Cta1p-GFP ergaben Hinweise auf eine mitochondriale Lokalisation des Fusionsproteins; eine von Kontaminationen freie Aufreinigung von Mitochondrien, welche einen eindeutigen Nachweis der mitochondrialen Lokalisation von Cta1p-GFP erlauben sollte, konnte trotz Anwendung verschiedenster Techniken jedoch nicht erreicht werden: Weder Variationen der Zellfraktionierung, noch Modifikationen der Organellaufreinigung mittels Gradienten, noch Veränderungen der Größe und Anzahl der Organellen führten zu einer mitochondrialen Fraktion ohne peroxisomale Kontamination. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass Cta1p-GFP bei Überexpression eine starke Tendenz zur Aggregatbildung aufweist; ein mitochondriales Targeting fand unter diesen Bedingungen nur in geringem Umfang und hauptsächlich in der stationären Wachstumsphase bei erhöhtem Sauerstoffstress statt. Unter der Kontrolle des Katalase-eigenen CTA1-Promotors war die Expression von Cta1p-GFP von der eingesetzten Kohlenstoffquelle abhängig. Während fermentative Bedingungen (Wachstum auf Glukose) die Bildung des Fusionsproteins nur wenig induzierten, führte die Kultivierung auf Ölsäure und Milchsäure zu hohen Expressionsraten von Cta1p-GFP. Unter diesen respiratorischen Bedingungen, die zur vermehrten ROS-Bildung führen, konnte in einem Anteil der Zellen ein mitochondrialer Import von Cta1p nachgewiesen werden. Versuche mit CTA-GFP-Varianten, in denen nur das N-terminale Drittel von Cta1p an GFP fusioniert wurde, ergaben Hinweise auf die mögliche Lage des mitochondrialen Targetingsignals in diesem Bereich des Proteins. Alternative Importstudien, welche die Untersuchung des mitochondrialen Targetings von Cta1p durch Überprüfung der respiratorischen Kompetenz der Zellen ermöglichen sollte, führten nicht zu aussagekräftigen Ergebnissen. Die Fortführung dieser Untersuchungen sollte jedoch dazu beitragen, den Zielsteuerungsmechanismus von Cta1p aufzuklären und das bislang noch unbekannte mitochondriale Targeting-Signal zu identifizieren. Phänotypische Analysen von Hefen, in denen der mitochondriale Import von Cta1p spezifisch blockiert war, gaben Aufschluss über die physiologische Relevanz der mitochondrialen Lokalisation von Cta1p. Im Hinblick auf erhöhten Sauerstoffstress, der sich aus einem vermehrten Durchfluss der Atmungskette bei Wachstum auf nicht-fermentativen Kohlenstoffquellen ergibt, konnte in den hier durchgeführten Wachstumsversuchen kein Unterschied zwischen Zellen mit und ohne mitochondrialer Katalase beobachtet werden. Jedoch führte spezifisch in den Mitochondrien ausgelöster Sauerstoffstress zu einem signifikanten Anstieg der ROS-Konzentration in Cta1p-defizienten Zellen im Vergleich zum Wildtyp. Vermutlich ist der Import von Cta1p in Mitochondrien besonders unter starken Stressbedingungen von Bedeutung und führt dabei zu einer intrazellulären Umverteilung von Katalase. Innerhalb der Mitochondrien kommt es hauptsächlich im Intermembranraum zur Bildung von H2O2. Die genaue intramitochondriale Lokalisation von Cta1p und der dem Kotargeting zugrunde liegende Importmechanismus von Cta1p sollen in weiterführenden Studien adressiert werden.
The aim of this thesis was to investigate the dual targeting of catalase A (Cta1p) into mitochondria and peroxisomes of the yeast Saccharomyces cerevisiae. By using a Cta1p-GFP-fusion, in which GFP was located at the carboxyterminus of Cta1p, strong evidence for a mitochondrial localisation of Cta1p was obtained with the help of immunochemical methods, fluorescence microscopy and enzyme activity tests. A possible negative influence on Cta1p targeting, eventually caused by the GFP-masked PTS1-signal, could be ruled out in several experiments: in vivo expression of CTA-GFP derivatives extended by the six C-terminal amino acids of Cta1p (SSNSKF) as well as studies using a c-myc-tagged CTA-variant proved both the correct peroxisomal targeting and excluded any mistargeting caused by a C-terminal tag in Cta1p. Cell fractionation experiments followed by immunochemical detection of Cta1p-GFP provided an additional indication for the mitochondrial localisation of Cta1p; however, purification of mitochondria free of contaminating peroxisomes was not achieved in spite of extensive variations of the cell fractionation protocol, the organelle purification procedure by using different types of gradients and various attempts aimed to alter either size, density or number of yeast peroxisomes and/or mitochondria. Fluorescence microscopy revealed a strong tendency of Cta1p-GFP for aggregation; under these conditions, mitochondrial targeting of Cta1p predominantly occurred in the stationary growth phase when oxidative stress increases. If CTA-GFP was expressed from its native CTA1 promotor, catalase expression depended on the carbon source. While fermentative growth conditions (glucose as carbon source) did not induce Cta1p-GFP expression, cultivation on oleate or lactate led to high expression of the protein fusion. Under these respiratory conditions, ROS formation is increased and mitochondrial import of Cta1p was detected at least in a small number of cells. Experiments using CTA-GFP variants in which the N-terminal third of catalase was fused to GFP provided further indication that the mitochondrial targeting signal of catalase is likely to be located in this part of the protein. Alternative studies on mitochondrial Cta1p targeting by assaying the regained respiratory competence of a yeast acp1 mutant did not allow conclusive interpretations. However, further investigations using this experimental strategy might elucidate the underlying targeting mechanism and the nature of the mitochondrial targeting signal in Cta1p. Phenotypical analysis of yeast cells lacking mitochondrial Cta1p activity uncovered the physiological relevance of mitochondrial catalase A localisation: although oxidative stress is significantly increased in cells growing on a non-fermentable carbon source, we could not detect any difference in growth behaviour between cells expressing or lacking mitochondrial catalase activity. Furthermore the influence of mitochondrial catalase was not strong enough to influence in vivo sensitivity against various killer toxins. However, oxidative stress specifically induced in yeast mitochondria by antimycin A treatment led to a significant increase of ROS accumulation in Cta1p-deficient cells. Therefore, we conclude that mitochondria stresses presumably result in a cross-distribution of Cta1p from peroxisomes into mitochondria to ensure rapid detoxification of H2O2 which is predominantly generated in the mitochondrial intermembrane space. The intramitochondrial localisation of Cta1p and the import mechanisms which are responsible for the cotargeting will be the aim of further investigations.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-6923
hdl:20.500.11880/22393
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22337
Erstgutachter: Schmitt, Manfred J.
Tag der mündlichen Prüfung: 27-Okt-2006
SciDok-Publikation: 2-Nov-2006
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
Fachrichtung: NT - Biowissenschaften
Fakultät / Institution:NT - Naturwissenschaftlich- Technische Fakultät

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