Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-22332
Titel: Liposomal drug carrier systems for inhalation treatment of lung cancer
Sonstige Titel: Liposomale Arzneistoffträgersysteme für die Inhalationsbehandlung des Lungenkrebses
Verfasser: Anabousi, Samah
Sprache: Englisch
Erscheinungsjahr: 2006
SWD-Schlagwörter: Tumor
Lungenkrebs
Liposom
Arzneistoffträger
Inhalationstherapie
Doxorubicin
Freie Schlagwörter: Liposomes
Inhalation
Lung Cancer
Doxorubicin
DDC-Sachgruppe: 610 Medizin, Gesundheit
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: Goal of this PhD project was the development of a novel anti-cancer therapy by using aerosols of Tf-modified liposomes for a local, thus less problematic, treatment of lung tumours. Since not much published data was available, the first step was to estimate the expression levels of TfR on cells originating from lung cancer, as well as from healthy lung tissues. The data show that TfR expression levels in healthy alveolar epithelial cells in primary culture were significantly lower than in A549 cells, a cell line derived from an adenocarcinoma of the distal lung. TfR expression levels in the continuously growing bronchial epithelial cell lines, Calu-3 and 16HBE14o-, were again significantly higher than those observed for the alveolar cell types. In general, all cell types showed TfR molecules located predominantly at their basolateral membranes, but cells undergoing mitotic proliferation at the time of fixation showed an additional strong signal for TfR on their apical aspect as well, due to the loss in cell polarity. After validating the applicability of TfR as a target molecule for our strategy, in an attempt to produce Tf-modified liposomes, three different linker lipids (DSPE-PEG2000-maleimide, N-glutaryl-PE and DSPE-PEG2000-COOH) were used. Many protocols have been published on the conjugation of proteins to surfaces of liposomes, but (visual) data on the quality and quantity of the claimed modifications are scarce. We successfully used atomic force microscopy (AFM) and transmission electron microscopy (TEM) as novel tools to visualise the actual conjugation of transferrin to the liposomal carrier. In addition, to quantify the conjugation efficiency, BCA-assays were performed and the phospholipid concentration was measured spectrophotometrically according to Stewart's method. The obtained date were then compared to the AFM and TEM results. The third step of the project was to test if the developed Tf-liposomes were actually able to delivery the payload to cancer cells at a higher rate than to their healthy counterparts. Again, in vitro cell culture techniques of several pulmonary epithelial cell types (both healthy and cancerous) were employed to give us some answers. Binding/uptake studies as well as cytotoxicity assays were carried out using the most promising candidates from our first study. Furthermore, we tested sterically-stabilised liposomes to assess the repulsive effect of the PEG-chains on the Tf-mediated uptake. We found that our Tf-liposomes can efficiently deliver the model drug, doxorubicin (DOX), to tumour cells and bypass the drug efflux mechanisms characteristic to multidrug resistance. The time-dependent uptake of liposomes into the cells showed a significantly higher uptake for the Tf-modified liposomes. When performed at 4°C or in the presence of excess free Tf, the experiments resulted in significantly lower fluorescence signals. The results of the cytotoxicity tests showed that primary cells were less affected by DOX encapsulated in Tf-liposomes than all cancerous cell lines used in this study. PEGylation generally decreased the binding/uptake, but only at a neglectable level. In the last part of my work, the liposomal system were tested for their suitability for aerosolisation. Plain and PEGylated Tf-liposomes were aerosolised by two different nebuliser types (i.e., air-jet and ultrasound) and their morphology was assessed by AFM and the integrity of the liposomal membranes by measuring the loss of encapsulated calcein. In additional studies, the stability of the liposomes in buffer solution was compared to the stability in an artificial lung surfactant (Alveofact®). The results lead to the conclusion that PEGylated and plain Tf-conjugated liposomes were both stable enough to undergo nebulisation, however, PEGylation was of advantage when it came to interaction between liposomes and the surfactant lining of the lungs. PEGylated liposomes were significantly more stable and retained >80% of their drug load over 48 h in artificial lung surfactant, which is more than sufficient time for the liposomes to be taken up by transferrin receptor over-expressing tumours in the lung. In general conclusion, this work could proof the feasibility to produce transferrin-conjugated liposomes, which can successfully deliver high amounts of anti-cancer drugs to pneumocytes of cancerous origin while having a low level of cytotoxicity in healthy cells. Furthermore, the developed liposomes are stable enough to undergo aerosolisation, a necessary prerequisite of oral inhalation. The liposomes also endure prolonged times in lung surfactant solutions without being compromised.
Ziel dieser Arbeit war es, eine neuartige Strategie im Kampf gegen den Lungenkrebs zu entwickeln. Dazu sollten drug targeting mittels Tf/TfR und Lokaltherapie der Lunge mittels Inhalation von Aerosolen kombiniert werden. Um die Validität der Hypothese zu überprüfen musste zuerst einmal ermittelt werden, ob Krebszellen des Lungenepithels ebenfalls erhöhte TfR Werte haben. Da es in der Literatur hierzu nur lückenhafte Hinweise gab, wurde die TfR Dichte verschiedener Lungenepitheltypen (normal und entartet) mittels indirekter Immunofluoreszenz (FACS) nachgewiesen. Die Ergebnisse der Studie ergaben, dass die Beobachtungen bei anderen Tumoren auch für Lungenkrebs zutreffen. Die auf ein Adenokarzinom der distalen Lunge zurückgehende Zelllinie A549 wies eine signifikant höhere TfR Anzahl auf als vergleichbare Alveolarepithelzellen in Primärkultur. Weiterhin stellten wir fest, dass beide untersuchten Zelllinien des Bronchialepithels (Calu-3 und 16HBE14o-) wiederum signifikant höhere Werte lieferten als die Alveolarzelltypen. Nach diesen Ergebnissen konnte die eigentliche Arbeit - die Entwicklung eines Arzneistoffträgers - aufgenommen werden. In der Literatur sind mehrere verschiedene Mechanismen beschrieben worden um Tf an Liposomen zu koppeln. Jedoch finden sich fast keine Hinweise wie der Erfolg der Kopplungsreaktion überprüft werden kann. In der Regel begnügt man sich hier mit einem Protein-Assay (z.B. BCA). Eine zusätzliche optische Darstellung der Kopplungseffizienz wurde bisher nicht beschrieben. Deshalb wurden in von uns 3 beschriebene Kopplungsmethoden für Tf ausprobiert und die Ergebnisse verglichen. Dies geschah mittels BCA-Protein-Assay und Bestimmung der Phospholipide nach Steward. Zusätzlich wurde die Proben in einem Rasterkraftmikroskop (oder AFM) und einem Transmissionselektronenmikroskop untersucht. Die Ergebnisse konnten nicht nur signifikante Unterschiede zwischen der Effizienz der verschiedenen Kopplungsverfahren aufzeigen, wir konnten auch weiterhin AFM und TEM als schnelle und zuverlässige Verfahren zur Darstellung von Protein-drug carrier Konjugation etablieren. Während AFM den Vorteil bietet, dass die zu untersuchende Probe nicht behandelt oder fixiert werden muss, kann beim TEM die die Empfindlichkeit des Verfahrens durch Verwendung von Antikörpern gegen das Zielprotein noch weiter erhöht werden. Als nächstes wurde untersucht, ob die Tf-Kopplung tatsächlich zu einer erhöhten Aufnahme von Liposomen in die Zellen führt, und wie zytotoxisch die Liposomen generell sind. Dazu wurden Bindungs- und Aufnahmeversuche sowie Zytotoxizitäts-Assays in verschiedenen Lungenepithelzelltypen in vitro durchgeführt. Zusätzlich wurde der Einfluss von PEG-Stabilisierung auf die Effektivität der Liposomen untersucht. Wiederum waren die Ergebnisse sehr viel versprechend: Die Tf.Kopplung resultierte in einer Vervielfachung der Aufnahme von Liposomen in die Krebszellen. Diese Aufnahme war beeinflussbar durch niedrige Temperaturen (4°C) und auch durch größere Mengen freies Tf im Versuchsmedium. Die einzelnen Werte für die Internalisierung korrelierten sehr gut mit den zuvor gemessenen TrF Dichten der einzelnen Zelltypen. PEGylierte Liposomen banden zwar etwas schlechter als "nackte", aber immer noch signifikant besser als Liposomen ohne Tf-Modifizierung. Bei den Zytotoxizitäts-Assays sah es ähnlich aus: die Tf-konjugierten Liposomen resultierten in hohen Absterberaten bei den Tumorzellen, während die Primärzellen deutlich weniger beeinflusst wurden. Im letzen Teil der Arbeit sollte schließlich ermittelt werden, ob die Liposomen überhaupt in der Lage sind ihre Ladung an den Wirkort zu bringen, d.h. ob sie den Scheerstress bei der Vernebelung überstehen und ob die Membranintegrität durch Lungensurfactant nachteilig beeinflusst wird. Einfache und PEGylierte Liposomen wurden in zwei verschiedenen Systemen (Druckluftdüse und Ultraschall) vernebelt und die Retention von Calcein wurde bestimmt. Zusätzlich wurde die Morphologie mittels AFM untersucht. Die liposomalen Formulierungen wurden weiterhin mit künstlichen Surfactant (Alveolfact®) inkubiert. Die Studien ergaben, dass der Einfluss von PEGylierung auf die Stabilität beim Vernebeln nicht allzu groß ist, jedoch war die Latenz von verkapselten Calcein in den Surfactant Versuchen deutlich höher. In der Zusammenfassung aller Versuche kann man schließen, dass die Aerosoltherapie mit Transferrin-modifizierten Liposomen ein sehr interessanter und Erfolg versprechender Ansatz in der Behandlung des Lungenkrebses ist. Die von uns entwickelten liposomalen Formulierungen sind in der Lage das Zielorgan zu erreichen und dort ihre Ladung selektiv an Krebszellen/Metastasen abzugeben. Diese Lokaltherapie sollte es ermöglichen die Tumoren gezielt zu bekämpfen, ohne den Körper schädigenden Konzentrationen des Zytostatikums auszusetzen.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-6626
hdl:20.500.11880/22388
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22332
Erstgutachter: Lehr, Claus-Michael
Tag der mündlichen Prüfung: 4-Sep-2006
SciDok-Publikation: 5-Sep-2006
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
Fachrichtung: NT - Pharmazie
Fakultät / Institution:NT - Naturwissenschaftlich- Technische Fakultät

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